吳文偉 鄭世翔 翁欽永 陳冬梅 (福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，福建 福州 35000)

金黃色葡萄球菌肺炎臨床上主要表現(xiàn)為支氣管膿性分泌物增多、寒戰(zhàn)、高熱、呼吸困難等癥狀〔1〕。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，金黃色葡萄球菌肺炎占肺炎的2% ～3%，尤其是兒童、年老體弱者發(fā)病率較高。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，柚皮素能夠改善金黃色葡萄球菌肺炎病情，本文通過觀察柚皮素治療金黃色葡萄球菌肺炎小鼠的情況，探討其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年清潔級(jí)雄性C57BL/6J小鼠90只，體重18～25 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)有限公司。采用抽簽法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組以及干預(yù)組，每組30只。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格依據(jù)中國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)提出的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、飼養(yǎng)方式、鼠齡無顯著性差異(P＞0.05)。

1.2主要試劑及儀器 柚皮素(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所);金黃色葡萄球菌8325-4菌(購(gòu)自愛爾蘭學(xué)院);小鼠白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β以及腫瘤壞死因子(TNF)-α的ELISA試劑盒(購(gòu)自Biolegend有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、紫外可見分光光度計(jì)、光學(xué)顯微鏡、低溫高速離心機(jī)均由福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3制備模型 雄性的C57BL/6J小鼠，體重18～25 g，均飼養(yǎng)于干凈的代謝籠中，每日給予充足的水源以及標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)動(dòng)物飼料，室內(nèi)環(huán)境控制在12/12 h黑白交替，溫度控制在20℃ ～25℃，濕度控制在55% ～60%范圍內(nèi)。小鼠1 w適應(yīng)后建立金黃色葡萄球菌肺炎模型。將金黃色葡萄球菌8325-4菌液15 μl經(jīng)模型組及干預(yù)組小鼠鼻孔緩慢滴入小鼠鼻腔內(nèi)。

1.4方法 隨機(jī)選取已造模的C57BL/6J小鼠60只，隨機(jī)分為模型組和干預(yù)組，每組30只。另外隨機(jī)選取正常C57BL/6J小鼠30只作為對(duì)照組。干預(yù)組小鼠給予柚皮素100 mg/kg，1次/12 h，皮下注射。2 d后，運(yùn)用頸椎脫臼方法處死小鼠，每組取10只小鼠，對(duì)肺內(nèi)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù);每組取10只小鼠，處理肺臟組織制作成病理切片，進(jìn)行病理學(xué)研究;每組取10只小鼠，對(duì)細(xì)胞因子IL-6、IL-1β以及TNF-α進(jìn)行測(cè)定。

1.5檢測(cè)方法

1.5.1菌落計(jì)數(shù) 在實(shí)驗(yàn)2 d后對(duì)每組10只小鼠頸椎脫臼處死，在無菌操作下取出肺臟，稱重、組織勻漿、稀釋，固定于培養(yǎng)基表層，恒溫箱培養(yǎng)24 h后顯微鏡下進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.5.2病理學(xué)觀察 在實(shí)驗(yàn)2 d后對(duì)每組10只小鼠頸椎脫臼處死，在無菌操作下取出肺臟，制作組織切片，光學(xué)顯微鏡下觀察病理情況，并進(jìn)行采集圖像。

1.5.3IL-6、IL-1β以及TNF-α測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)2 d后對(duì)每組10只小鼠頸椎脫臼處死，運(yùn)用ELISA方法對(duì)肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β 以及 TNF-α 進(jìn)行測(cè)定，用 IL-6、IL-1β 以及 TNF-α ELISA試劑盒。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1菌落計(jì)數(shù) 2 d后，模型組(5.9×106CFUs/mg)與干預(yù)組(2.3×104CFUs/mg)肺內(nèi)菌落計(jì)數(shù)較對(duì)照組(1.0×102CFUs/mg)均有所增加(P＜0.05);與模型組比較，干預(yù)組肺內(nèi)菌落計(jì)數(shù)均有所改善(P＜0.05)。

2.2病理學(xué)觀察 HE染色后觀察到，對(duì)照組中肺內(nèi)組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡邊緣整齊，肺泡腔內(nèi)無異常;金色葡萄球菌8325-4肺炎模型組中的肺內(nèi)組織結(jié)構(gòu)模糊，無法識(shí)別，大量細(xì)菌彌漫在整個(gè)肺內(nèi)，無肺泡結(jié)構(gòu)，部分炎性細(xì)胞破裂壞死，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞部分壞死，其腔內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞，同時(shí)血管周圍水腫，并有纖維組織滲出;柚皮素干預(yù)組小鼠肺內(nèi)組織中，部分肺泡腔融合，肺泡壁毛細(xì)血管呈現(xiàn)略有擴(kuò)張、少量的充血以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 三組肺臟病理改變(HE，×400)

2.3各組IL-6、IL-1β以及TNF-α水平測(cè)定 2 d后，模型組與干預(yù)組IL-6、IL-1β以及 TNF-α均有所增加(P＜0.05);與模型組比較，干預(yù)組IL-6、IL-1β以及TNF-α均有所改善(P＜0.05)。見表1。

表1 各組小鼠IL-6、IL-1β以及TNF-α水平(s，pg/ml，n=10)

表1 各組小鼠IL-6、IL-1β以及TNF-α水平(s，pg/ml，n=10)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 IL-6 IL-1β TNF-α干預(yù)組 284.82±21.541)2) 80.23±12.361)2) 125.75±14.371)2)模型組 785.69±50.311) 289.33±26.361) 384.74±26.181)對(duì)照組134.25±25.36 46.36±8.23 51.36±9.75

3討論

金黃色葡萄球菌肺炎是肺炎中較重的一種，具有較高的死亡率和發(fā)病率〔3〕。而金黃色葡萄球菌主要致病力取決于外毒素，這些外毒素協(xié)助金黃色葡萄球菌侵入宿主〔4〕。α-溶血素就是其中主要的一種外毒素，是影響金黃色葡萄球菌致病力中主要的一種，特別是在肺炎的發(fā)病機(jī)制中必不可少。柚皮素是柚皮甙的甙元，屬于二氫黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化等功能〔5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示柚皮素對(duì)金黃色葡萄球菌肺炎有很好的抗菌作用，能夠抑制金黃色葡萄球菌的繁殖，對(duì)肺炎具有一定的療效。病理學(xué)改變提示柚皮素對(duì)金黃色葡萄球菌肺炎的肺內(nèi)組織具有很好的保護(hù)作用，可能其機(jī)制與抑制α-溶血素有關(guān)〔6～9〕，從而阻止金黃色葡萄球菌的侵襲。并且柚皮素對(duì)于金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺泡灌液相關(guān)的細(xì)胞因子具有一定的改善作用。

柚皮素可顯著減少金葡菌肺炎感染小鼠肺組織中菌落數(shù)目，能夠明顯緩解金黃色葡萄球菌肺炎炎癥，值得推廣。

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