李 燕 楊 濤 李 靜 楊 潔 羅建民 郝洪嶺 王素云 李 杰 袁 軍 王瑞倉 陳 華

(河北省人民醫(yī)院血液科，河北 石家莊 050051)

多發(fā)性骨髓瘤是骨髓內(nèi)漿細(xì)胞異常增生的一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在中、老年群體中具有較高的發(fā)病率，并以50～60歲之間為多，40歲以下罕見〔1〕?；颊吲R床大多表現(xiàn)出不同程度的貧血、骨痛、腎功能不全、反復(fù)感染、出血等。而各種分子遺傳學(xué)異常現(xiàn)象會(huì)對(duì)疾病的發(fā)展產(chǎn)生一定的影響，并對(duì)其危險(xiǎn)度分層和預(yù)后等產(chǎn)生較大的影響〔2〕。本研究利用熒光原位雜交法對(duì)初治多發(fā)性骨髓瘤及人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的分子遺傳學(xué)異常進(jìn)行檢測(cè)和比較，篩選細(xì)胞腫瘤高危遺傳學(xué)異常。

1 資料與方法

1.1一般資料 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系7株分型與來源見表1。我院2011年12月至2014年12月83例初治多發(fā)性骨髓瘤患者設(shè)為對(duì)照組，其中男50例，女33例，年齡31～84歲，行骨髓穿刺抽取骨髓液。主要儀器和試劑包括DNA探針(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、離心涂片機(jī)(上海思伯明儀器設(shè)備有限公司)、雙色雙融合探針(上海信裕生物科技有限公司)、胃蛋白酶(湖北生物科技發(fā)展有限公司)、原位雜交儀(杭州奧盛儀器有限公司)。其中，雙色雙融合探針包括SpeetrunOrangeTM和SpeetmnGreenTM標(biāo)記的IGH/CCND1和IGH/FGFR3及IGH/MAF雙色雙融合探針。

1.2處理標(biāo)本 對(duì)玻片分別進(jìn)行泡酸和酒精浸泡處理，然后對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行復(fù)蘇，分析染色體核型，并利用PBS液進(jìn)行細(xì)胞重懸。每張玻片加70 μl細(xì)胞懸液置于離心涂片機(jī)中予以5 min離心，離心結(jié)束利用甲醇、冰醋酸(3∶1)進(jìn)行10 min固定后妥善保存，保存溫度設(shè)置為－20℃。梯度離心細(xì)胞，獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞后利用PBS液獲得細(xì)胞懸液備用。向細(xì)胞中添加 CD138磁珠，添加量為每5×106個(gè)細(xì)胞10 μl CD138磁珠，于4℃條件下進(jìn)行15 min的孵育后進(jìn)行過柱分離，得到漿細(xì)胞，取3×105個(gè)漿細(xì)胞，利用1 ml PBS液予以重懸將玻片擦干之后，每張玻片加70 μl細(xì)胞懸液置于離心涂片機(jī)中予以5 min離心。離心結(jié)束進(jìn)行固定并保存?zhèn)溆?，保存溫度設(shè)置為－20℃。

表1 7株人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系情況

1.3熒光原位雜交 對(duì)細(xì)胞涂片進(jìn)行10 min的老化，條件設(shè)置:37℃ 2×SSC，然后置于37℃ 0.2 mg/ml的胃蛋白酶中進(jìn)行10 min孵育后于室溫條件下，利用2×SSC進(jìn)行3 min漂洗。然后分別利用75%、85%、100%的酒精脫水，每次脫水1 min。脫水完畢之后，在暗環(huán)境條件下，將1 μl去離子水和7 μl雜交緩沖液2 μl探針進(jìn)行混合，并使之充分均勻。將10 μl反應(yīng)體系加入每張標(biāo)本中，添加完畢加蓋玻片，四周封牢。置于原位雜交儀中，于78℃條件下進(jìn)行5 min的熱變性，并分別為42℃條件下復(fù)性16 h。將雜交后的玻璃片去掉蓋玻片，立即置于72℃條件下進(jìn)行0.4×SSC/0.3×NP40中進(jìn)行2 min清洗。并于常溫條件下進(jìn)行再次清洗，晾干。然后將抗衰變劑及DAPI復(fù)染液添加到每一張片子上，并利用配有三色色濾光片的熒光顯微鏡計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1初治多發(fā)性骨髓瘤和骨髓瘤細(xì)胞系遺傳學(xué)異常檢出情況初治多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞遺傳學(xué)總體檢出率為85.54%(71/83)，伴有 RB-1缺失 39例(45.88%)、出現(xiàn) P53缺失 18例(21.18%)、伴有1q21擴(kuò)增46例(54.12%)、存在IGH異常54例(63.53%)、IGH/CCND1 陽性 24 例(28.24%)、IGH/FGFR3陽性 22例(25.88%)、IGH/MAF 陽性3例(3.53%)。

2.2初治多發(fā)性骨髓瘤和骨髓瘤細(xì)胞系遺傳學(xué)異常比較 利用不同的DNA探針進(jìn)行檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)所有人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系以及大部分初治多發(fā)性骨髓瘤中均存在分子遺傳學(xué)異常，但二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。且人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系同時(shí)合并多種遺傳學(xué)異常的情況較為多見。1例為人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系伴有IGH/CCND1，且IGH/FGFR3陽性檢出率顯著高于初治多發(fā)性骨髓瘤(P＜0.05)。6例人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系具有1q21的擴(kuò)增，但與初治多發(fā)性骨髓瘤之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在RB-1缺失方面，人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系與初治多發(fā)性骨髓瘤之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但在P53缺失方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，IGH/MAF陽性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);但在1q21擴(kuò)增和IGH異常、IGH/CCNDl陽性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

3討論

多發(fā)性骨髓瘤是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，可以對(duì)人體的各臟器造成損害。隨著疾病的進(jìn)展，多發(fā)性骨髓瘤可出現(xiàn)髓外侵犯，甚至轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞白血病。整個(gè)過程中，細(xì)胞和分子遺傳學(xué)的異常事件的積累發(fā)揮了出重要的作用。在正常狀態(tài)下，漿細(xì)胞會(huì)生成各種抗體，并發(fā)揮出強(qiáng)大的抗感染作用。但是，當(dāng)漿細(xì)胞發(fā)生癌變的時(shí)候，正常的細(xì)胞功能會(huì)受到較大的影響，且出現(xiàn)異常的增殖現(xiàn)象，無法發(fā)揮正常的生理功能〔3，4〕。而這些大量增殖功能異常的漿細(xì)胞侵犯到人體各臟器，引發(fā)重要器官病變。臨床對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者進(jìn)行治療的時(shí)候，大多采用化療等方式。為了提高化療效果，需要做好對(duì)疾病的準(zhǔn)確分期，其中，細(xì)胞遺傳學(xué)檢查是一種常見的檢查方式〔5〕。通過對(duì)患者進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，在細(xì)胞里發(fā)現(xiàn)染色體異?！?〕。多發(fā)性骨髓瘤常伴有細(xì)胞遺傳學(xué)的異常，大部分人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系來源于骨髓外漿細(xì)胞腫瘤，其遺傳學(xué)異常可以對(duì)各種高度侵襲性漿細(xì)胞腫瘤的遺傳學(xué)特征予以較好反映〔7，8〕。多發(fā)性骨髓瘤常伴有細(xì)胞遺傳學(xué)的異常，其遺傳學(xué)異常分為非超二倍體和超二倍體兩類，其中超二倍體被列為低危組，伴有超二倍體的患者常常預(yù)后較好，表現(xiàn)出更好的生存優(yōu)勢(shì)〔9，10〕。漿細(xì)胞腫瘤的顯著特征便是基因組高度不穩(wěn)定。本研究中，人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系和初治多發(fā)性骨髓瘤在IGH異常檢出率不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;分析出現(xiàn)這一結(jié)果的原因，可能是因?yàn)镮GH易位出現(xiàn)于多發(fā)性骨髓瘤的早期病變階段，因此，對(duì)于是否存出現(xiàn)了IGH異常，并不會(huì)隨著疾病的發(fā)展而出現(xiàn)相應(yīng)的改變〔11〕。本次研究結(jié)果中，有1例為人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系伴有IGH/CCND1，且IGH/FGFR3陽性檢出率顯著高于正常多發(fā)性骨髓瘤。分析出現(xiàn)這一結(jié)果的原因，可能是受到本次研究所檢測(cè)細(xì)胞學(xué)數(shù)量相對(duì)較少的影響，選擇存在偏移。因此，還需要在擴(kuò)大樣本分析。1號(hào)染色體不穩(wěn)定是惡性漿細(xì)胞腫瘤的重要特征，疾病的發(fā)展可能與定位于1號(hào)染色體的基因異常之間存在一定的關(guān)系〔12，13〕。13號(hào)染色體異常是多發(fā)性骨髓瘤常見的遺傳學(xué)異常。p53是一種抗癌基因，因編碼一種分子質(zhì)量為53 kD的蛋白質(zhì)而得名〔14〕。p53蛋白質(zhì)能夠遏制細(xì)胞的增殖，具有遏制癌細(xì)胞的作用，可以作為重要的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控150多種基因的表達(dá)。p53是機(jī)體內(nèi)最重要一種抑癌因子，當(dāng)p53正常發(fā)揮功能時(shí)，它參與細(xì)胞分裂的調(diào)控。而當(dāng)某些原因例如基因突變使得p53蛋白功能出現(xiàn)異常時(shí)，則會(huì)引起失控性細(xì)胞分裂最終有可能導(dǎo)致癌癥發(fā)生〔15〕。位于染色體17p13的抑癌基因p53的缺失會(huì)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后效果產(chǎn)生較大的影響，如果出現(xiàn)p53缺失的伴隨情況，則多發(fā)性骨髓瘤常常和循環(huán)漿細(xì)胞梳理的增加相關(guān)，提示腫瘤細(xì)胞容易與骨髓微環(huán)境出現(xiàn)分離，產(chǎn)生單獨(dú)存在的情況。而絕大多數(shù)大部分人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系來源于骨髓外漿細(xì)胞腫瘤，p53缺失是人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的顯著特征。

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