洪小平 陳 濤 周 珍 邱 斌 向 雄 余 晨 朱瀟旭 韓永明

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

有研究者認(rèn)為，阿爾茨海默病(AD)病人認(rèn)知功能的下降與過度磷酸化的tau蛋白聚集所形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)具有明顯相關(guān)性，而AD動物實驗也證實tau蛋白磷酸化水平與學(xué)習(xí)記憶能力存在明顯的負(fù)相關(guān)〔1～4〕。葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，據(jù)《本草綱目》中記載其性涼、氣平、味甘，具清熱、降火、排毒等功效。葛根素是從葛根中提取的單體化合物，是葛根的主要有效成分之一，可有效改善AD患者的癥狀〔5，6〕，并對AD模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力有明顯的促進作用〔7〕，但其作用機制仍不十分清楚。本研究旨在觀察葛根素對自然衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及大鼠海馬內(nèi)tau蛋白磷酸化水平的影響，探討葛根素在防治AD疾病中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠，20～22月齡(500±50)g，由華中科技大學(xué)實驗動物中心提供(No.SYXK鄂2010-0057)，清潔級。

1.2 主要儀器 Morris水迷宮自動實驗記錄儀，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供;顯微照相機(Olympus，日本);MK3型酶標(biāo)儀(Thermo，美國);超聲組織破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);垂直型電泳槽、濕式電轉(zhuǎn)膜槽、轉(zhuǎn)膜儀及電源均購自北京市六一儀器廠;掃描儀(Canon，日本)。

1.3 主要試劑 葛根素(康普藥業(yè)股份有限公司，批號過藥準(zhǔn)字H200439880);丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺(Amresco，美國);苯甲基磺酰氟溶液(PMSF)、蛋白提取細(xì)胞裂解(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，美國);PS396(Invitrogen，美國)、Tau-1(Millipore，美國);Tau-5(Thermo，美國);β-actin 抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司;增強化學(xué)發(fā)光(ECL)底物液(Thermo，美國);顯影定影試劑盒購自武漢巴菲爾生物有限公司;四氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自美國Sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組與給藥 將經(jīng)過Morris水迷宮訓(xùn)練6 d進行初篩的老年大鼠12只隨機均分為對照組(NS)、葛根素干預(yù)組(Puerarin)。每天于10∶00～11∶00給兩組老年鼠進行腹腔注射生理鹽水(NS)或葛根素(Puerarin，80 mg·kg－1·d－1)，連續(xù)注射4 w。動物造模結(jié)束后，采用Morris水迷宮對兩組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進行檢測，隨后常規(guī)灌注取腦，經(jīng)4%多聚甲醛后固定12～14 h后，保存于含0.02%NaN3的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，存放于4℃冰箱中。

將20只老年大鼠隨機分為對照組(NS)、葛根素低劑量(40 mg·kg－1·d－1，n=5)、葛根素中劑量(80 mg·kg－1·d－1)、葛根素高劑量組(160 mg·kg－1·d－1)，每組 5只。每天早晨10∶00～11∶00給予生理鹽水或葛根素腹腔注射，連續(xù)4 w。

將10只老年大鼠隨機均分為對照組(NS)和葛根素干預(yù)組(80 mg·kg－1·d－1)，同上述處理方法連續(xù)進行 12 w。以上動物處理結(jié)束后，經(jīng)深度麻醉后迅速斷頭取腦，于冰盤上分離雙側(cè)海馬組織，保存于-70℃冰箱中。

1.4.2 學(xué)習(xí)與記憶能力檢測 采用Morris水迷宮自動記錄系統(tǒng)對老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進行檢測。Morris水迷宮自動記錄系統(tǒng)由不銹鋼圓形水池和自動錄像分析系統(tǒng)兩部分組成。圓形水池直徑120 cm，高38 cm，池壁貼以黑膜，水深30 cm，水溫保持在(22±2)℃。將大鼠面朝池壁分別由4個象限放入水中，記錄其在60 s內(nèi)尋找隱蔽平臺(低于水面1.2 cm)所需的時間(即逃避潛伏期)及游泳軌跡。若達(dá)60 s仍未找到平臺，則人為引導(dǎo)其至平臺，停留30 s，本次成績記錄為60 s。每天測試4次，連續(xù)測試3 d。

1.4.3 免疫組織化學(xué)法 將腦組織置于30%蔗糖·PB溶液中沉糖后進行連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚30 μm，每隔9張取一張，依次抽取6張，按鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SABC)法對切片進行免疫組化染色:3%牛血清白蛋白(BSA)室溫孵育1 h，兔抗PS396(1∶500)或鼠抗Tau-1(1∶10 000)4℃孵育過夜，生物素化羊抗兔/羊抗鼠(1 ∶200)孵育1 h，SABC(1 ∶200)孵育 1 h，DAB/H2O2顯色5～10 min;常規(guī)脫水、透明、封片。用一抗稀釋液代替一抗作為陰性對照，結(jié)果呈陰性。

1.4.4 免疫蛋白印跡 將海馬取出后，按1∶9的比例加入蛋白勻漿提取液，0～4℃提取制成10%蛋白勻漿，加入1/3體積的4×上樣緩沖液，煮沸 10 min使蛋白變性，4℃離心(12 000 r/min，15 min)。采用BCA法測定樣品的蛋白含量，各泳道蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗 PS396(1 ∶1 000)/Tau-1(1 ∶10 000)/Tau-5(1 ∶1 000)/βactin(1∶1 000)4℃孵育過夜。經(jīng)Tris鹽酸緩沖液(TBS)漂洗3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，再經(jīng)TBS緩沖液漂洗3次后，加入ECL顯色液孵育5 min，暗室內(nèi)將膜置于感光膠片上曝光適當(dāng)時間后，沖洗膠片。將膠片掃描后，采用BandScan 4.3圖像軟件對結(jié)果進行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0軟件進行組間比較采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對老年大鼠一般情況的影響 葛根素對老年大鼠的體重?zé)o明顯影響，但經(jīng)過葛根素處理的大鼠活動增加、反應(yīng)更為敏捷。老年大鼠在接受高劑量葛根素處理后顯得煩躁易怒，也更容易出現(xiàn)皮下出血等不良反應(yīng)。

2.2 葛根素對老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 在藥物處理前，兩組大鼠經(jīng)Morris水迷宮連續(xù)訓(xùn)練6 d后，均能在10 s左右尋找到隱蔽平臺，兩組之間無顯著差異。經(jīng)藥物處理4 w后第1天，兩組動物尋找隱蔽平臺的平均潛伏期無明顯差異(P＞0.05);兩組大鼠尋找隱蔽平臺的策略也都較為隨意，象限的定向性不明顯(圖1A)。但是，葛根素處理的老年大鼠在測試第2天尋找平臺的潛伏期明顯縮短(P＜0.01);其搜索策略也更為簡單，定向性更為明確;而對照組大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績提高不明顯。兩組大鼠在測試第3天的學(xué)習(xí)記憶成績較第2天均有明顯提高，但兩組之間成績無顯著性差異。見圖1B。

2.3 葛根素對老年大鼠海馬內(nèi)tau蛋白磷酸化水平的影響本文主要采用PS396和Tau-1對大鼠海馬內(nèi)tau蛋白磷酸化水平進行測定，采用Tau-5檢測大鼠海馬內(nèi)總Tau蛋白的表達(dá)。Western結(jié)果顯示，經(jīng)過4 w葛根素連續(xù)注射后，低、中、高劑量的葛根素均可明顯增高Tau-1在海馬內(nèi)的表達(dá)，但這種作用并未隨劑量的增長而成比例增長(圖2A、2B)。葛根素對Ser396位點磷酸化水平的影響不顯著(圖2A、2B)。不同劑量的葛根素對總Tau蛋白的表達(dá)均無明顯影響(圖2A、2B)。經(jīng)過12 w葛根素連續(xù)注射，老年大鼠海馬內(nèi)Tau-1的表達(dá)明顯高于老年對照組，但對Ser396位點tau蛋白磷酸化水平的影響仍不明顯(圖2C、2D)。免疫組化的結(jié)果也顯示，葛根素組老年鼠海馬內(nèi)CA3區(qū)與齒狀回(DG)區(qū)Tau-1的著色明顯深于老年對照組，但兩組之間PS396的表達(dá)在海馬各區(qū)差異不明顯。見圖3。

圖1 葛根素對老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

圖2 葛根素對老年大鼠海馬內(nèi)tau蛋白磷酸的水平的影響

圖3 老年大鼠海馬內(nèi)PS 396與Tau-1在CA3區(qū)及DG區(qū)的表達(dá)

3 討論

AD典型臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能進行性減退，并以近期記憶力下降更明顯〔1，2〕。由于AD的發(fā)病機制極為復(fù)雜，目前尚無一種動物模型可全面再現(xiàn)AD患者的行為學(xué)、病理及生化等全部病變特征?，F(xiàn)代流行病學(xué)調(diào)查顯示，衰老是AD發(fā)病的重要危險因素〔1〕。

葛根在傳統(tǒng)中醫(yī)中主要用于治療脾虛泄瀉、消渴、心悸及頭暈等癥，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)則證實葛根提取物具有改善心腦血管的循環(huán)、降低血糖、增強免疫力等作用，因而目前廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療〔8〕。葛根素是葛根的主要有效成分之一，陳煒等〔6〕研究顯示葛根素可有效改善AD患者的癥狀，且安全性良好。來自衰老模型的動物實驗也證實葛根素可明顯改善大鼠及小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔7〕。本研究結(jié)果顯示衰老的大鼠經(jīng)過葛根素處理一定時間后其學(xué)習(xí)記憶能力明顯增強，并且葛根素對老年大鼠近期記憶能力的改善更為明顯。

Tau蛋白是神經(jīng)細(xì)胞中含量最高的微管相關(guān)蛋白，大量研究表明Tau蛋白在促進微管聚集、維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定、參與軸突運輸及生長以及維持細(xì)胞生存等多種重要的生物學(xué)功能中均發(fā)揮著重要作用〔8〕。磷酸化修飾是調(diào)節(jié)Tau蛋白的正常生物學(xué)功能的重要機制之一，然而在AD患者腦內(nèi)Tau蛋白被異常過度磷酸化、以配對螺旋絲結(jié)構(gòu)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)在細(xì)胞內(nèi)聚集〔9〕。臨床資料研究顯示，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的數(shù)量與其癡呆程度成正相關(guān)〔10〕。目前在AD大腦中已檢測到Tau蛋白至少在包括絲氨酸396、404、199、202位點及蘇氨酸231、235位點等30多個位點的磷酸化水平異常〔4〕。大量體外研究證實，Tau蛋白的異常修飾會使其正常的生物學(xué)功能遭到嚴(yán)重影響，主要表現(xiàn)為Tau蛋白促微管組裝的活性降低、神經(jīng)元軸突轉(zhuǎn)運障礙、蛋白酶體活性受到抑制等，這些功能的異?？蓪?dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生慢性退行性改變〔4〕。來自AD模型動物的實驗結(jié)果顯示，Tau蛋白異常增高的磷酸化水平與認(rèn)知功能的損害存在明顯的相關(guān)性，而抑制異常Tau蛋白的表達(dá)可明顯改善受損的認(rèn)知功能〔11〕?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，有學(xué)者提出適時適度的干預(yù)Tau蛋白異常修飾的發(fā)生，或可阻止或延緩AD的神經(jīng)退行性病變〔3〕。在本研究中結(jié)果顯示，老年大鼠經(jīng)不同濃度葛根素干預(yù)一定時間后，其大腦海馬內(nèi)Tau蛋白在絲氨酸199/202位點的磷酸化水平明顯降低。葛根素對Tau蛋白磷酸化水平的作用并未隨劑量的增加而進一步加強，但這種現(xiàn)象似乎與動物對葛根素的適應(yīng)性無關(guān)。將葛根素的作用時間由4 w延長到12 w，結(jié)果顯示葛根素降低Tau蛋白在絲氨酸199/202位點的磷酸化水平的作用仍十分顯著。聯(lián)系動物的一般行為表現(xiàn)，認(rèn)為采用低等劑量的葛根素對老年動物進行干預(yù)，動物的耐受性更好、安全性更高，對腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平的調(diào)節(jié)也更為有效。

綜上所述，葛根素可增強老年大鼠的學(xué)習(xí)及近期記憶能力，機制可能與其降低大鼠海馬內(nèi)Tau蛋白在絲氨酸199/202位點的磷酸化水平有關(guān)。在以后的研究中，將進一步觀察葛根素對Tau蛋白其他位點磷酸化水平的影響并探索其影響Tau蛋白磷酸化的分子機制，為闡明葛根素改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用機制及應(yīng)用于臨床實踐提供更加豐富、堅實的理論依據(jù)。

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