谷成英 賀艷菊 王朝迅 曾藝鵬 周里鋼

（復旦大學附屬浦東醫(yī)院內分泌科 上海 201399）

追趕生長是指營養(yǎng)缺乏導致的生長抑制在營養(yǎng)恢復后可出現(xiàn)代償性生長，在發(fā)展中國家普遍存在。動物研究表明，追趕生長大鼠發(fā)生基因的表觀遺傳學改變，如肝細胞過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子－1（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator－1，PGC－1）和肉毒堿脂酰基轉移酶的基因組蛋白H3／K9乙?；皆黾樱梢餚GC－1α的增加及肉毒堿脂?；D移酶表達降低，可導致肝糖輸出增加及肝細胞脂肪酸B氧化障礙，引起肝臟糖脂代謝紊亂［1－2］及脂肪肝，后者是我國2型糖尿病的獨立危險因素。因此，研究追趕生長導致2型糖尿病的機制對于我國2型糖尿病的早期防治至關重要。SIRT1通過感受細胞內NAD＋水平而活性受到調節(jié)，具有組蛋白去乙?；头墙M蛋白去乙酰化作用，非組蛋白包括PGC－1α／過氧化物酶體增殖活化受體α（peroxisome proliferator activated receptorα，PPARα）、核因子－κB（nuclear factor－kappa B，NF－κB）等分子［3］。主要在肝細胞合成的糖脂代謝調節(jié)因子成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21），通過作用于肝細胞 PPAR－α受體而受到調節(jié)［4－5］，調節(jié)FGF21可通過磷酸化的ERK1／2／GLUT1信號通路而改善肝細胞胰島素抵抗，可促進胰腺胰島素的分 泌［6］。因此，SIRT1－PPARα／PGC－1α－FGF21 或SIRT1／NF－κB的作用環(huán)節(jié)可反應肝細胞乙?；瘜Ω闻K糖脂代謝、免疫炎性反應和胰島素分泌過程的影響。追趕生長狀態(tài)下，SIRT1如何通過肝臟乙?；接绊懸葝u素抵抗及SIRT1在飲食干預中的作用如何，其機制不明。因此，本研究以普通飲食為對照組，通過觀察肝細胞 SIRT1－PPARα／PGC－1α及下游相關分子的變化，研究追趕生長導致脂肪肝改變、胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂的影響機制以及低熱卡飲食的干預機制，這對于防止2型糖尿病的發(fā)生有著重要意義。

材料和方法

動物模型 6周齡SPF級雄性SD大鼠24只，體質量140～160 g，飼養(yǎng)于同濟大學動物實驗中心，室溫控制在（22±1）℃，晝夜節(jié)律為12 h：12 h。適應性喂養(yǎng)1周后，分別單籠喂養(yǎng)，自由飲水。大鼠隨機分為3組，即對照組8只，高脂追趕生長模型組（簡稱模型組）8只，飲食干預組8只。對照組一直以普通飼料喂養(yǎng)。追趕生長模型在適應性喂養(yǎng)結束以后，改喂以60%熱卡限制的普通飼料4周，普通飲食的熱能構成比為：蛋白質22．4%，脂肪11．8%，碳水化合物65．8%；之后給予高脂飼料，分為模型和飲食干預組，模型組隨后一直給予高脂飲食；飲食干預組在限食4周后給與高脂飲食喂養(yǎng)6周，然后恢復到普通飲食喂養(yǎng)，自由進食6周。高脂飼料營養(yǎng)成分中，粗蛋白、脂肪及碳水化合物含量（百分比）分別為21．3（19%）、21（42%）和43．8（39%）。普通飲食與高脂飼料由上海斯萊克實驗動物公司提供。

口服葡萄糖耐量和胰島素釋放功能實驗 大鼠禁食15 h，按2 g／kg 50%葡萄糖灌胃做口服葡萄糖耐量測試（oral glucose tolerance test，OGTT）。用美國羅氏血糖儀檢測0、15、30、60、120 min時的血糖，并用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測其血清胰島素水平，計算葡萄糖曲線下面積、胰島素曲線下面積、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA－IR）；殺鼠前1周同樣方法做OGTT、胰島素釋放功能實驗（the insulin release test，IRT）。實驗過程中檢測肝功能、血脂、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HBA1C）?？偰懝檀迹╰otal cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low densith lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）及游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）以酶法檢測，HBA1C以高壓液相法檢測。

動物處理 每周稱重1次，計算各組大鼠生長中體質量變化，描繪各組大鼠生長曲線，觀察限食期間及開放飲食期間，各組大鼠的生長特點；處死前1周行OGTT（羅氏卓越血糖檢測儀）和IRT（ELISA方法）。處死前大鼠稱重，禁食12h后，腹腔注射20%烏拉坦（5 mL／kg體質量）麻醉動物，固定，局部消毒后打開腹腔，從腹主動脈采血，室溫下放置約10 min后，2 000×g離心10 min，取上清至無菌EP管中，－20℃保存，留取血樣查谷丙轉氨酶、HBA1C、TG、TC、LDL、HDL、FFA；迅速分離肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪，在無菌條件下稱肝臟濕重，計算肝臟指數(shù)（肝臟重量與大鼠體質量的比值），取附睪與腎周脂肪稱重，計算內臟體脂，即：（附睪脂肪＋腎周脂肪）與大鼠體質量比值；取部分肝臟用4%的甲醛固定，留作石蠟包埋、切片后的肝臟HE染色；每組取兩只大鼠肝臟組織以戊二醛固定，留作透射電鏡觀察肝臟超微結構；取另一部分肝臟放置－70℃保存。

肝細胞SIRT1、FGF21、NF－KB蛋白含量 以Western blot檢測；抗SIRT1抗體（批號：ab110304，英國Abcam公司）；抗FGF21抗體（批號LS－B5864，美國LifeSpan BioSciences公司）；抗NF－κB p65抗體（批號：sc－372，美國santa cruz biotechnology公司）。

real－time PCR檢測PPAR－α、PGC－1α基因 mRNA表達水平 大鼠肝細胞PPAR－α、PGC－1α分子引物序列 如 下：PGC－1α：5′－CGCACAACTCAGCAAGTCCTC－3′ （正向），5′－CCTTGCTGGCCTCCAAAGTCTC－3′（反向 ）。PPAR－α：5′－GTGGCTGCTATAATTTGCTGTG－3′（正 向 ），5′－GAAGGTGTCATCTGGATGGGT（反向）。real－time PCR實驗用 T熒光定量PCR試劑盒（中國寶生物工程大連有限公司），按說明書步驟進行。

胰島素、谷丙轉氨酶、血脂的檢測 采用ELISA方法檢測胰島素，批內及批間變異系數(shù)均小于10%；谷丙轉氨酶以IFCC法檢測胰島素，TG、TC及FFA以酶法檢測，HBA1C采用高壓液相法檢測，均由德國羅氏診斷公司提供；LDL及HDL以免疫分離法檢測，由日本第一化學藥品株式會社提供試劑盒。

電鏡技術 取肝臟切成1 mm3小塊固定于2%戊二醛固定液，反復洗滌后用1%鋨酸溶液作用后固定，酒精系列脫水，環(huán)氧樹脂包埋，LKB超薄切片機切片，醋酸鈾與檸檬酸鉛染色，H－600型電子顯微鏡觀察與照相。切片制作及顯微鏡觀察和照相均在上海中醫(yī)藥大學病理科完成。

葡萄糖、胰島素曲線面積及HOMA－IR的計算葡萄糖曲線下面積和胰島素曲線下面積的計算依據不規(guī)則梯形公式。HOMA－IR＝空腹胰島素（uIU／mL）×空腹血漿血糖（mmol／L）÷22．5。

統(tǒng)計學處理 利用SPSS 18軟件分析檢驗資料的正態(tài)性和方差齊性，非正態(tài)分布的資料進行對數(shù)轉換使其符合正態(tài)分布，數(shù)據以±s表示，兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計圖表的制作在Graphpad Prism5上完成。

結 果

大鼠能量吸收及生長情況 按照每周稱重得到的生長曲線顯示，追趕生長大鼠組在60%限食期間生長停滯，開放高脂飲食后1周出現(xiàn)快速增長，干預前模型組體質量增長仍不及對照組，但此后持續(xù)增長，明顯大于其他組（動物處理前3周模型組與對照組比較P值分別為0．038，0．05，0．031）?；謴驼ｏ嬍车淖汾s生長大鼠，即飲食干預組，體質量明顯低于模型組（動物處理前4周P值分別為0．034，0．001 6，0．003，0．002 7，圖1）。

圖1 大鼠生長曲線Fig 1 Growth curve of rats

OGTT及IRT結果 大鼠追趕生長早期OGTT及IRT實驗顯示，追趕生長組大鼠60 min血糖明顯高于對照組（P＝0．011），120 min仍未回到餐前狀態(tài)；其胰島素水平低平，胰島素曲線下面積明顯降低（P＝0．012，表1）；干預結束時模型組空腹胰島素明顯增高，胰島素曲線下面積明顯增高（P均值為0．006）。各組葡萄糖曲線下面積差異無統(tǒng)計學意義（表2）；模型組HOMA－IR明顯高于對照組（P＝0．026），飲食干預明顯改善空腹胰島素、胰島素曲線下面積及HOMA－IR（P值分別為0．033，0．037，0．039，表2）。

表1 大鼠追趕生長早期葡萄糖耐量試驗及胰島素釋放功能特點分析Tab 1 The analysis of glucose tolerance test and insulin release function in the earlier period of catch－up growth in rats

表2 飲食干預對追趕生長大鼠糖脂代謝、胰島素抵抗、肝功能及內臟脂肪、肝臟指數(shù)的影響Tab 2 Effect of dietary intervention on glucose and lipid metabolism，insulin resistance，liver function，visceral fat and liver index in rats with catch－up growth （±s）

表2 飲食干預對追趕生長大鼠糖脂代謝、胰島素抵抗、肝功能及內臟脂肪、肝臟指數(shù)的影響Tab 2 Effect of dietary intervention on glucose and lipid metabolism，insulin resistance，liver function，visceral fat and liver index in rats with catch－up growth （±s）

TG：Triglyceride；TC：Total cholesterol；FFA：Free fatty acid；ALT：The natural logarithm of alanine amiotransferase；HBA1C：Glycosylated hemoglobin；FPG：Fasting plasma glucose；FIN：The natural logarithm of fasting insulin；HOMA－IR：Insulin resistance index；AUCG：The area under glucose curve；AUCIN：The area under insulin curve；Liver weight：Wet liver weight；P1：Pvalue of CUGFR group vs．NC group；P2：P value of Diet－G group vs．CUGFR group．

Item（unit）NC CUGFR Diet－G P1 P2 TG（mmol／L）0．768±0．13 0．815±0．27 0．972±0．10 0．710 0．250±0．29 1．766±0．66 0．690 0．470 TC（mmol／L）1．464±0．411．545 LDL－C （mmol／L） 0．193±0．12 0．538±0．20 0．22±0．16 0．006 0．020 HDL－C （mmol／L） 1．133±0．40 0．925±0．10 1．558±0．48 0．198 0．011 FFA （mmol／L） 0．466±0．11 0．345±0．08 0．612±0．19 0．031 0．011 ALT （IU／L） 3．49±0．07 4．10±0．38 3．74±0．14 0．004 0．083 HBA1c／% 3．85±0．11 3．86±0．10 3．83±0．09 0．850 0．550 FPG （mmol／L） 6．58±1．19 6．0±0．37 6．73±0．69 0．280 0．059 FIN （ng／mL） 1．575±0．340 2．429±0．387 1．401±0．803 0．006 0．033 HOMA－IR 1．75±0．98 3．22±1．30 1．59±0．69 0．026 0．039 AUCG （mmol／L） 1171．42±83．93 1163．5±46．81 1284．13±150．14 0．875 0．096 AUCIN （ng／mL） 80．39±44．04 185．48±46．68 104．17±55．34 0．006 0．037 Weight（g） 774．5±39．2 786±48．3 674．6±33．1 0．101 0．002 Liver weight（g） 17．14±1．78 31．67±2．47 17．96±1．9 0．000 0．000 Liver index 2．31±0．25 4．03±0．17 2．66±0．22 0．000 0．000 Visceral fat（g） 31．94±6．41 42．55±10．62 25．4±7．57 0．038 0．015 Visceral fat index 4．29±0．82 5．40±1．24 3．75±1．07 0．018 0．015

飲食干預對糖脂代謝及肝功能的影響 高脂飲食喂養(yǎng)的模型組，LDL－C明顯增高（P＝0．006），游離脂肪酸明顯降低（P＝0．031）。低熱卡的飲食干預組，LDL－C明顯降低（P＝0．02），HDL、游離脂肪酸較模型組明顯增高（P＝0．011）。追趕生長后期模型組糖化血紅蛋白較對照組無明顯異常（P＝0．85）。追趕生長后期有輕度肝功能不良，模型組谷丙轉氨酶較對照組差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＝0．004），飲食干預組有減輕肝功能異常的趨勢（P＝0．083），但較對照組差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

追趕生長對內臟脂肪及肝臟指數(shù)的影響及飲食的干預作用：與正常對照組比較，追趕生長大鼠肝臟濕重、肝臟指數(shù)、內臟脂肪、內臟脂肪指數(shù)均明顯增加（P 分別為0．000，0．000，0．038，0．018），而在飲食干預下上述指標可明顯減少（P分別為0．000，0．000，0．015，0．015，表2）。

飲食干預對追趕生長大鼠肝臟病理及超微結構的影響 肝臟HE染色顯示：模型組大鼠肝組織內大量的脂滴沉積，有炎性細胞浸潤，飲食干預組大鼠肝細胞結構明顯恢復，仍有炎性細胞浸潤，未見明顯脂滴（圖2）。

肝臟透射電鏡顯示：模型組大鼠脂滴多，可融合，線粒體脊多消失，線粒體膜消失；核膜不完整，可見核膜孔，飲食干預組脂滴很少，線粒體嵴可見，但排列紊亂，內可見脂質包涵體及空泡，核膜較厚但完整，核居邊（圖2）。

追趕生長大鼠NF－κB、SIRT1、FGF21、PPAR－α、PGC－1α相關分子異常及飲食干預 追趕生長大鼠NF－κB明顯增高（P＝0．036），而SIRT1、FGF21蛋白及PPAR－α基因表達明顯降低（P分別為0．041，0．048，0．035），PGC－1α表達增加（P＝0．129），但差異無統(tǒng)計學意義。飲食干預可明顯增加SIRT1水平（P＝0．034），對FGF21、NF－κB、PPAR－α、PGC－1α的影響則無統(tǒng)計學意義（圖3、4）。

討 論

中國等發(fā)展中國家在經歷嚴重饑荒40～50年后出現(xiàn)2型糖尿病患病率的大幅增長［7－8］，提示飲食缺乏因素可能會對整個國家人群的基因產生影響。因而在此背景下存在著大量飲食缺乏生長抑制后的快速生長，即追趕生長現(xiàn)象。近年來，越來越多的學者認為，肝臟是2型糖尿病發(fā)病的源頭，脂肪肝是2型糖尿病的危險因素，但追趕生長導致肝臟糖脂代謝紊亂及脂肪肝的機制至今未明。

圖2 肝細胞透射電鏡與肝臟HE染色Fig 2 Transmission electron microscopy of liver cells and liver HE staining

肝臟胰島素抵抗是非酒精性脂肪肝發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，免疫炎癥、氧化應激是重要的發(fā)病因素［9－10］，本研究顯示，追趕生長大鼠存在明顯的糖脂代謝異常、炎性因子的增高及胰島素抵抗，這與文獻報道結果一致［11］。本實驗模型反映的是經過限食階段后開放高脂飲食的追趕生長狀況及機制。不同于生理情況的是，經歷限食階段后，在高脂飲食狀況下SIRT1及相關肝細胞代謝分子PPARa、FGF21明顯降低，經歷CR階段后，高脂飲食明顯降低SIRT1及相關肝細胞代謝分子PPARα、FGF21，PGC－1α變化并不明顯。分析可能是下面原因綜合作用的結果：（1）隨著SIRT1降低，PGC－1α與之形成的復合物減少，PGC－1α下降；（2）SIRT1降低時肝細胞PGC－1基因組蛋白乙酰化水平增加，PGC－1α表達增加。追趕生長大鼠肝細胞降低的SIRT1、PPARα與FGF21對于胰島素分泌的影響是，出現(xiàn)明顯的高胰島素血癥及胰島素抵抗，脂肪肝進行性加重，表現(xiàn)明顯的脂肪肝病理特征、輕度肝功能異常。追趕生長所導致的SIRT1－PPAR－α相關的肝臟胰島素抵抗信號通路病理機制，以及SIRT1對胰腺胰島素分泌的影響途徑，還需進一步研究。

飲食干預是2型糖尿病防治的基礎環(huán)節(jié)。基于上述發(fā)病機制，對于普遍存在著追趕生長的發(fā)展中國家，飲食干預尤其重要。文獻顯示，SIRT1可增加肝細胞PPAR－α表達［12］，食用含糖指數(shù)低的糙米，可增加肝細胞SIRT1的表達而改善糖尿病前期患者代謝參數(shù)，如內臟脂肪含量，降低炎癥標志物［13－14］。本實驗結果提示，低熱卡飲食能明顯提高肝細胞SIRT1蛋白水平，明顯降低體質量、內臟脂肪及肝臟指數(shù)，脂肪肝病理結構明顯好轉，胰島素抵抗及肝功能有明顯改善，此與文獻報道一致；推測低熱卡飲食可能通過增強體內SIRT1介導的去乙酰化作用，經SIRT1－PPAR－α－FGF21路徑調節(jié)肝臟糖脂代謝及脂肪肝，從而影響胰島素抵抗程度及胰島分泌功能。

上述分析表明，肝細胞乙?；皆龈咚鶎е碌奶侵x相關分子表達異常，可能是導致追趕生長后肝臟胰島素抵抗及胰島素釋放功能異常的重要機制，低熱卡飲食干預有可能通過改變體內乙酰化水平防止2型糖尿病的發(fā)生。

圖3 SIRT1、FGF21、NF－κB蛋白水平及PPAR-α、PGC－1α基因表達Fig 3 Protein levels of SIRT1，F(xiàn)GF21，NF－κB and the gene expression of PPAR－α，PGC－1α

圖4 SIR1、FGF21和NF－κB蛋白電泳結果Fig 4 Protein electrophoresis results of SIRT1，F(xiàn)GF21and NF－κB

［1］ Simmons RA．Developmental origins of diabetes：the role of epigenetic mechanisms［J］．Curr Opin endocrinol，2007，1（14）：13－16．

［2］ Feil R．Environmental and nutritional effects on the epigenetic regulation of genes［J］．Mutat Res，2006，600（1－2）：46－57．

［3］ Yeung F，Hoberg JE，Ramsey CS，et al．Modulation of NF－kappaB－dependent transcription and cell survival by the SIRT1 deacetylase［J］．EMBO J，2004，23（12）：2369－2380．

［4］ Dushay J，Chui PC，Gopalakrishnan GS，et al．Increased fibroblast growth factor 21 in obesity and nonalcoholic fatty liver disease［J］．Gastroenterology，2010，139（2）：456－463．

［5］ Li H，F(xiàn)ang Q，Gao F，et al．Fibroblast growth factor 21 levels are increased in nonalcoholic fatty liver disease patients and are correlated with hepatic triglyceride［J］．J Hepatol，2010，53（5）：934－940．

［6］ 李婷婷，高麗昌，唐祿，等．成纖維細胞生長因子－21改善胰島素抵抗肝細胞對葡萄糖的吸收及機制［J］．中國藥理學通報，2012，28（3）：366－371．

［7］ van Abeelen AF，Elias SG，Bossuyt PM，et al．Famine Exposure in the Young and the Risk of Type 2 Diabetes in Adulthood［J］．Diabetes，2012，9（61）：2255－2260．

［8］ Li Y，He Y，Qi L，et al．Exposure to the Chinese Famine in Early Life and the Risk of Hyperglycemia and Type 2 Diabetes in Adulthood［J］．Diabetes，2010，10（59）：2400－2406．

［9］ Li L，Hai J，Li Z，et al．Resveratrol modulates autophagy and NF－κB activity in a murine model for treating nonalcoholic fatty liver disease［J］．Food Chem Toxicol，2014，63：166－173．

［10］ Gariani K，Philippe J，Jornayvaz FR．Non－alcoholic fatty liver disease and insulin resistance：from bench to bedside［J］．Diabetes Metab，2013，39（1）：16－26．

［11］ Hu X，Chen LL，Zheng J，et al．Increases in systemic and local stress：aprobable mechanism of visceral fat accumulation and insulin resistance in adult catch－up growth rats？［J］．Exp Biol Med，2013，238（1）：57－65．

［12］ Caton PW，Holness，MJ，Bishop－Bailey D，et al．PPAR alpha－LXR as a novel metabolostatic signalling axis in skeletal muscle that acts to optimize substrate selection in response to nutrient status［J］．Biochem J，2011，437（3）：521－530．

［13］ Martínez I，Lattimer JM，Hubach KL，et al．Gut microbiome composition is linked to whole grain－induced immunological improvements［J］．ISME J，2013，7（2）：269－280．

［14］ Wang B，Raj M，Xu J，et al．Effects of a whole rice diet on in prediabetes［J］．e－SPEN ，2013，8（1）：15－20．