郭磊，吳鶴云，張成林，2，3，徐慶陽(yáng)，2，3，謝希賢，2，3，陳寧，2，3

1(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457)

2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

尿苷(Uridine)是一種重要的核苷類物質(zhì)，參與生物體的生命活動(dòng)，是合成碘苷、溴苷及氟苷等核苷類抗病毒抗腫瘤藥物的中間體，具有很高的醫(yī)用價(jià)值及廣闊的市場(chǎng)前景［1－2］。

尿苷生產(chǎn)方法主要為RNA水解法和化學(xué)合成法，前者面臨優(yōu)質(zhì)原材料分離困難和產(chǎn)品的產(chǎn)銷失衡等關(guān)鍵問(wèn)題，后者由于使用大量的有機(jī)試劑而造成對(duì)環(huán)境的不友好且因步驟繁瑣、難度高、周期長(zhǎng)，導(dǎo)致無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)［3］。

隨著微生物育種技術(shù)的發(fā)展，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)尿苷也逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。該方法的生產(chǎn)菌株主要為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，因其戊糖磷酸途徑強(qiáng)且磷酸單酯酶活力高而較其他微生物更具有產(chǎn)苷潛力［4－7］。

本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)前期菌種選育已獲得1株具備尿苷積累能力的枯草芽孢桿菌B.subtilisUR1。通過(guò)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基成分的改變?cè)谟绊懢w生長(zhǎng)的同時(shí)，也對(duì)尿苷的積累量影響很大。為了使菌株產(chǎn)苷能力得到更大的提高，對(duì)有必要對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。

目前常用的培養(yǎng)基優(yōu)化方法主要有單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法［8－11］。其中響應(yīng)面法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，周期短，精度高，考察全面等優(yōu)點(diǎn)，是降低開發(fā)成本、提高產(chǎn)品質(zhì)量的一種有效方法，已成功應(yīng)用到食品、生物、化工等諸多領(lǐng)域［12－13］。

本文采用響應(yīng)面法系統(tǒng)地對(duì)菌株產(chǎn)尿苷發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提升尿苷積累量，也為尿苷的產(chǎn)業(yè)化提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:枯草芽孢桿菌B.subtilisUR1(△hom、△pyrR、△pdp、△nupC、△xylR::prsNL、pyrABTTKV)，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院代謝工程研究室保存。

斜面培養(yǎng)基(/L):葡萄糖1 g，蛋白胨10 g，牛肉膏 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 2.5 g，瓊脂 20 g。

種子培養(yǎng)基(/L):葡萄糖20 g，豆粕水解液20 mL，酵母粉 10 g，NaCl 2.5 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO41 g，谷氨酸鈉 5 g，L-蘇氨酸(L-Threonine，Thr)、L-甲硫氨酸(L-Methionine，Met)、L-異亮氨酸(LIsoleucine，Ile)各 0.03 g，VB3、VB5、VB12各 0.1 mg。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(/L):葡萄糖80 g，豆粕水解液30 mL，酵母粉 15 g，玉米漿 20 mL，MgSO4·7H2O 8 g，(NH4)2SO415 g，KH2PO42.5 g，谷氨酸鈉 15 g，Thr、Met、Ile 各 0.03 g，VB3、VB5、VB12各 0.1 mg。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(/L):葡萄糖80 g，豆粕水解液41 mL，酵母粉 25.6 g，玉米漿 20 mL，MgSO4·7H2O 8 g，(NH4)2SO415 g，KH2PO42.5 g，谷氨酸鈉 25.2 g，Thr、Met、Ile 各 0.03 g，VB3、VB5、VB12各 0.1 mg。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面培養(yǎng)

用接種環(huán)接種1環(huán)從－80℃取出的凍存菌液，均勻劃線于斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h，并傳代1次。

1.2.1.2 種子培養(yǎng)

用接種環(huán)刮取1環(huán)斜面種子接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，9層紗布封口，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。

1.2.1.3 發(fā)酵

吸取3 mL種子液接種于裝有27 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板三角瓶中，9層紗布封口，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.1.4 取樣

分別在培養(yǎng)時(shí)間12、24、36、48和60 h時(shí)刻用無(wú)菌移液管于無(wú)菌操作間中吸取發(fā)酵液1 mL，測(cè)定生物量及殘?zhí)橇俊?/p>

1.2.1.5 補(bǔ)糖

以經(jīng)高壓蒸汽滅菌(115℃，15 min)后的濃度為800 g/L的葡萄糖為母液，根據(jù)菌體耗糖速率補(bǔ)入所需量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 生物量測(cè)定

取發(fā)酵液200 μL加入到9.8 mL去離子水中充分混勻，以經(jīng)過(guò)同樣處理的空白培養(yǎng)液作為參比，用分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值，OD600×50即為生物量。

1.2.2.2 殘?zhí)菧y(cè)定

將發(fā)酵液于室溫13 000 r/min離心2 min，取上清液10 μL加入至990 μL去離子水中充分混勻，然后取25 μL采用SBA-40E系列生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定其殘?zhí)橇浚鶞y(cè)值×100即為發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，單位為mg/100 mL。

1.2.2.3 尿苷產(chǎn)量測(cè)定

取離心后的發(fā)酵液上清液100 μL加入到900 μL去離子水中，以1 g/L尿苷作為標(biāo)準(zhǔn)樣品并作相同的稀釋處理，全部樣品經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后采用HPLC測(cè)定發(fā)酵液中尿苷產(chǎn)量。采用的色譜柱為Phenomenex Gemini 5u C18110A 150 mm ×4.6 mm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=2∶98，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為 10 μL，分析時(shí)間 12 min。

1.2.2.4 單位菌體產(chǎn)苷量

以每組發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)苷量與生物量(OD600)的比值來(lái)衡量單位菌體產(chǎn)苷量［g/(L·OD600)］。

2 結(jié)果與討論

2.1 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響尿苷產(chǎn)量的顯著因素

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是由Plackett-Burman提出的一種基于不完全平衡塊原理的2水平部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。它是一種篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能以最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)和盡可能高的精確度從眾多實(shí)驗(yàn)因子中識(shí)別出對(duì)響應(yīng)值影響最大的因素［14－15］。

在前期實(shí)驗(yàn)確定的葡萄糖初始濃度80 g/L的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用N=12的PB設(shè)計(jì)，對(duì)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕水解液，酵母粉，玉米漿，(NH4)2SO4，Mg-SO4·7H2O，KH2PO4，谷氨酸鈉，Thr、Met、Ile，VB3、VB5、VB12，共計(jì)9種成分進(jìn)行考察，每個(gè)因素取2個(gè)水平－高水平(+)和低水平(－)，其中高水平為低水平的1.5倍，響應(yīng)值Y為尿苷產(chǎn)量(g/L)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及發(fā)酵72 h后尿苷產(chǎn)量見表1。利用Minitab16軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，各因素的編碼水平、主效應(yīng)分析見表2。其中P值大小代表了該因素的顯著性水平，P＜0.05說(shuō)明該因素效應(yīng)顯著，P＜0.01則效應(yīng)極顯著。由結(jié)果可知，酵母粉、谷氨酸鈉、豆粕水解液、MgSO4·7H2O為對(duì)尿苷產(chǎn)量有顯著影響的因素，選取前三者進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表1 N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 1 Experimental design and response values of Plackett-Burman(N=12)

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只在考察區(qū)域的領(lǐng)域范圍內(nèi)較真實(shí)地反映真實(shí)情況，而在遠(yuǎn)離該領(lǐng)域范圍時(shí)幾乎無(wú)相關(guān)性。因此，根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)得出的初步結(jié)果，結(jié)合各因子變化的方向，選取合適的步長(zhǎng)，利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)來(lái)尋找響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)往往被當(dāng)作不可缺少的一項(xiàng)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行［16－17］。

表2 各因子實(shí)驗(yàn)水平及主效應(yīng)分析Table 2 Levels of variables and analysis of the main effect

根據(jù)表2的分析結(jié)果，酵母粉、谷氨酸鈉、豆粕水解液都具有顯著的正效應(yīng)，都應(yīng)增加。因此，根據(jù)三者的效應(yīng)大小確定了最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的步長(zhǎng)及變化方向，其余因素均取初始水平。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。由結(jié)果可知，最佳因素濃度的條件位于第7組附近，故取第7組實(shí)驗(yàn)條件為中心點(diǎn)實(shí)施下一步的響應(yīng)面分析。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素5水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。以發(fā)酵72 h后尿苷的產(chǎn)量Y(g/L)為響應(yīng)值，以2.3中第7組實(shí)驗(yàn)條件為中心點(diǎn)，各因素的編碼水平見表4，中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表4 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素及水平Table 4 Factors and levels of central composite design

表5 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Central composite design and corresponding results

利用Minitab 16軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，并擬合出響應(yīng)值Y與A、B、C三因素之間的二次回歸模型為:

該回歸模型的方差分析及可信度分析分別見表6和表7。由表6可以看出，該模型的F值為149.73，P(Prob＞F)＜0.000 1，說(shuō)明該模型顯著。由可信度分析表可知，該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.992 6，說(shuō)明模型可以解釋99.26%的實(shí)驗(yàn)所得出的尿苷產(chǎn)量的變化，模型擬合度良好。變異系數(shù)CV值表示實(shí)驗(yàn)的精確度，值越低代表實(shí)驗(yàn)可靠性越高。本實(shí)驗(yàn)CV=1.79%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作可信。Adeq Precision代表信噪比，通常情況下其值應(yīng)大于4，本實(shí)驗(yàn)為30.449，進(jìn)一步說(shuō)明該模型可以很好地駕馭整個(gè)實(shí)驗(yàn)空間。綜上，模型的選取基本正確。

表6 回歸方程的方差分析Table 6 ANOVA analysis for regression equation

表7 模型的可信度分析Table 7 Fitstatistics for Y

上述模型中的3個(gè)因素與響應(yīng)值Y(尿苷，g/L)的相互作用可以直觀地從圖1的響應(yīng)面圖中反映出來(lái)。由圖1可以看出，響應(yīng)值Y存在最大值，經(jīng)過(guò)軟件的進(jìn)一步分析得出，Y的最大值為Y=13.76 g/L，此時(shí)3個(gè)因素的值為A=0.298 8，B=0.106 9，C=0.446，對(duì)應(yīng)的實(shí)際添加濃度為酵母粉25.6 g/L，谷氨酸鈉25.2 g/L，豆粕水解液40.9 mL/L。

2.4 模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性及重復(fù)性，以上述得出的各因素濃度配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并以初始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵過(guò)程曲線如圖2所示。

圖1 酵母粉(A)、谷氨酸鈉(B)和豆粕水解液(C)三因素影響尿苷產(chǎn)量的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots of the effects of yeast extract(A)，monosodium glutamate(B)and soybean meal hydrolysate(C)on uridine yield

發(fā)酵結(jié)果各參數(shù)見表8。優(yōu)化后的菌體生物量比優(yōu)化前提高了11.2%，葡萄糖消耗量提高了51.0%，優(yōu)化后尿苷產(chǎn)量與預(yù)測(cè)值非常接近，比優(yōu)化前提高了164.1%。此外，單位菌體的尿苷生成量也提高了138.5%。可見，模型的選取基本正確。

表8 發(fā)酵結(jié)果各參數(shù)Table 8 Parameters of the fermentation results

3 結(jié)論

首先利用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出了對(duì)尿苷產(chǎn)量影響顯著的3個(gè)因素:酵母粉、谷氨酸鈉、豆粕水解液。其中，酵母粉和豆粕水解液含有豐富的有機(jī)氮源，是菌體生長(zhǎng)過(guò)程中合成蛋白質(zhì)、核酸和其他許多初級(jí)以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要來(lái)源［18］，在尿苷的從頭合成途徑中，這些氮源物質(zhì)還是合成嘧啶環(huán)的前體物，具有極其重要的作用，直接影響到發(fā)酵產(chǎn)苷量。除此之外，它們含有的少量維生素和微量元素是菌體生長(zhǎng)代謝中重要酶的輔酶或輔因子，能夠保證菌體生長(zhǎng)良好。尿苷屬于初級(jí)代謝產(chǎn)物，只有在一定生物量的基礎(chǔ)上，才有可能使之充分發(fā)揮產(chǎn)苷能力。谷氨酸鈉一方面能夠很好地促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，另一方面作為谷氨酸供體，大大增加了尿苷從頭合成途徑的氨基來(lái)源。

圖2 優(yōu)化前(實(shí)心)與優(yōu)化后(空心)培養(yǎng)條件下發(fā)酵過(guò)程曲線圖Fig.2 Curves of the fermentation process under original(solid symbols)and optimal(open symbols)conditions

通過(guò)響應(yīng)面分析，我們得到了能夠很好地反映尿苷產(chǎn)量變化的二次回歸模型。通過(guò)求解回歸方程，我們得出了尿苷產(chǎn)量最大值的預(yù)測(cè)值，通過(guò)模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了該預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性和可靠性。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，各因素的濃度分別為酵母粉26 g/L，谷氨酸鈉25 g/L，豆粕水解液41 mL/L。這比初始培養(yǎng)基中各成分的濃度均提高了約1%，說(shuō)明了優(yōu)化后的培養(yǎng)基碳氮比更合適，培養(yǎng)條件更適宜菌體生長(zhǎng)，尿苷的從頭合成途徑更為通暢，而使菌體能更多地積累尿苷。

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