李化東，黃顯明，盧鳳英，丁美娟，張小飛

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230061；2. 南京天邦生物科技有限公司，南京 211102）

血清1型和3型鴨甲型肝炎病毒二重RT-PCR檢測(cè)方法的建立

李化東1，2，黃顯明2，盧鳳英2，丁美娟2，張小飛2

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230061；2. 南京天邦生物科技有限公司，南京 211102）

根據(jù)鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）的基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，分別建立檢測(cè)鴨甲型肝炎病毒血清1型（DHAV-1）和鴨甲型肝炎病毒血清3型（DHAV-3）的RT-PCR方法。通過對(duì)PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化建立了鑒別血清1型和血清3型DHAV的二重RT-PCR檢測(cè)方法，DHAV-1和DHAV-3目的片段大小分別為751bp和448bp，而且對(duì)其他禽病病原的PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性試驗(yàn)表明該檢測(cè)方法最低檢測(cè)量為10 pg的DHAV-1和8 pg的DHAV-3模板。因此，本研究建立的二重RT-PCR檢測(cè)方法可用于DHAV-1和DHAV-3感染的臨床樣品的快速鑒別診斷。

鴨甲肝病毒血清1型；鴨甲肝病毒血清3型；二重RT-PCR

由鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起的鴨肝炎自20世紀(jì)50年代在美國被發(fā)現(xiàn)以后，迅速在世界養(yǎng)鴨地區(qū)爆發(fā)和蔓延，成為危害我國養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的疫病。2002年蘇敬良等［1］報(bào)道北京市和廣西壯族自治區(qū)等地免疫過鴨肝炎疫苗或注射過鴨肝炎高免卵黃抗體的鴨群仍然發(fā)生鴨肝炎，并且證明分離到的鴨肝炎病毒與經(jīng)典的鴨肝炎病毒無血清學(xué)交叉反應(yīng)，故暫稱新型鴨肝炎病毒。2007年，臺(tái)灣學(xué)者Tseng［2］和韓國學(xué)者Kim［3］分別分離到不同于經(jīng)典的鴨肝炎病毒的新型鴨肝炎病毒。通過分子生物學(xué)和血清學(xué)鑒定表明，臺(tái)灣和韓國分離的新型鴨肝炎病毒均屬DHAV，但他們之間也存在著明顯的血清學(xué)差異?，F(xiàn)已明確將DHAV分為3個(gè)血清型［4］，即經(jīng)典的鴨肝炎病毒、臺(tái)灣新型鴨肝炎病毒和韓國新型鴨肝炎病毒分別對(duì)應(yīng)血清1型DHAV（DHAV-1）、血清2型DHAV（DHAV-2）和血清3型DHAV（DHAV-3）。

在我國，隨著針對(duì)DHAV-1活疫苗和高免卵黃抗體的應(yīng)用，DHAV-1引起的鴨肝炎已得到有效控制，但由于近十年來新出現(xiàn)的DHAV-3引起的鴨肝炎又成為制約我國養(yǎng)鴨生產(chǎn)新的嚴(yán)峻問題。本研究建立的同時(shí)檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3二重RT-PCR方法，為臨床診斷和檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3感染提供了快速適用的技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 材料 新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck revovirus， NDRV）、鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV）、鴨瘟病毒（Duck plague virus， DPV）、血清1型鴨甲型肝炎病毒A66株（DHAV-1）和血清3型鴨甲型肝炎病毒分離株（DHAV-3）均由南京天邦生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室保存；抗DHAV-1、DHAV-3血清由本實(shí)驗(yàn)室制備提供。2013年8月～2014年6月，采集于山東省、江蘇省和安徽省等地鴨場(chǎng)疑似鴨肝炎的肝臟病料11份，-20℃保存。

1.2 試劑 病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒購自Biomed生物公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制、dNTP、Ex-Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）、pMD18-T載體均購自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)DHAV-1 A66株（GenBank登錄號(hào)：DQ886445）和DHAV-3 JS2010株（GenBank登錄號(hào)：HQ654774）全基因組序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)了2對(duì)鑒定引物，特異性擴(kuò)增DHAV-1鑒定引物P1 /P2和DHAV-3鑒定引物P3 /P4，引物由上海生物工程有限公司合成，見表1。

表1 二重RT-PCR引物序列Table 1 Duplex PCR primers sequences

1.4 RNA提取 將DHAV-1和DHAV-3尿囊液按照Biomed生物公司的病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒提取RNA，加入適量的DEPC處理水溶解。

1.5 二重RT - PCR檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化 參考AMV說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用25 μL體系，對(duì)退火溫度從50℃～60℃進(jìn)行優(yōu)化，再以最佳退火溫度對(duì)引物濃度（0.5、1.0、1.5、2 μmol/mL）及反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化，連接至pMDl8-T載體進(jìn)行克隆，然后送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 特異性試驗(yàn) 采用建立的二重RT-PCR方法分別檢測(cè)NDV、NDRV、DTMUV、DPV、DHAV-1、DHAV-3與DHAV混合物，以檢測(cè)其特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將提取的DHAV-1和DHAV-3的cDNA用紫外分光光度儀分別測(cè)定其含量，然后分別進(jìn)行10倍系列稀釋，將系列稀釋的cDNA作為模板進(jìn)行二重RT-PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)其敏感性。

1.8 臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)11份華東部分地區(qū)臨床疑似DHAV感染病鴨的肝臟病料進(jìn)行二重RT-PCR檢測(cè)。

1.9 臨床樣品的病毒分離鑒定 將上述11份臨床肝臟病料樣品，用滅菌生理鹽水按1∶5（W/V）勻漿、離心和除菌過濾處理后，經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚進(jìn)行病毒分離，盲傳3代，收獲死胚胚體和尿囊液，采用DHAV-1、DHAV-3特異性血清進(jìn)行鴨胚中和試驗(yàn)鑒定分離病毒。

2 結(jié)果

2.1 二重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化 通過對(duì)引物濃度、退火溫度以及反應(yīng)體系等反應(yīng)條件的反復(fù)優(yōu)化，最終確定，反應(yīng)體系為25 μL：DHAV-1和DHAV-3的等量混合模板2 μL，DHAV-1、DHAV-3上下游引物各0.5 μmol/mL，Taq酶預(yù)混劑12.5 μL，加滅菌ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 40 s，53℃退火 40 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。DHAV-1和DHAV-3分別擴(kuò)增出約751 bp和448 bp片段，與預(yù)期大小一致。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)分析表明，擴(kuò)增的目的片段與DHAV-1 CH2010和DHAV-3 JS2010等相應(yīng)序列同源性分別為100%。

2.2 特異性試驗(yàn) 特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，只有DHAV-1和DHAV-3能夠分別擴(kuò)增出約751 bp和448 bp的特異性條帶，而NDV、NDRV、DTMUV、DPV均未擴(kuò)增出條帶，結(jié)果見圖1。

圖1 二重RT-PCR方法的特異性檢測(cè)Fig.1 Specifi city test of the duplex RT-PCR

2.3 敏感性試驗(yàn) 結(jié)果顯示建立的二重RT-PCR方法對(duì)DHAV-1和DHAV-3的核酸最低檢出量分別為10 pg和8 pg，結(jié)果見圖2。

圖2 二重RT-PCR方法的敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity test of the duplex RT-PCR

2.4 臨床樣品檢測(cè) 采用二重RT-PCR方法對(duì)11份華東部分地區(qū)臨床上各鴨場(chǎng)疑似DHAV感染病鴨肝臟病料進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果檢出DHAV-1陽性病料1份（1/11），DHAV-3陽性病料7份（7/11），同時(shí)檢出DHAV-1和DHAV-3的陽性病料2份（2/11），1份病料檢測(cè)為陰性（1/11），結(jié)果見圖3。

圖3 二重RT-PCR檢測(cè)臨床樣品結(jié)果Fig.3 The detection rusults of DHAV-1 and DHAV-3 inclinical samples by duplex RT-PCR

2.5 臨床樣品的病毒分離和鑒定 將11份疑似DHAV病鴨肝臟等病料接種10日齡鴨胚后，進(jìn)行病毒分離，結(jié)果顯示二重RT-PCR陽性的病料經(jīng)鴨胚病毒分離均成功分離到DHAV（10/10），1份PCR檢測(cè)陰性的病料未分離到病毒。采用抗DHAV-1、DHAV-3特異性血清對(duì)分離病毒進(jìn)行鴨胚中和試驗(yàn)進(jìn)行病毒鑒定，結(jié)果1份RT-PCR檢測(cè)DHAV-1陽性病料的分離病毒能被抗DHAV-1血清中和，7份RT-PCR檢測(cè)DHAV-3陽性病料的分離病毒能被抗DHAV-3血清中和，2份RT-PCR檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3混合感染的陽性病料，經(jīng)交叉中和試驗(yàn)證明分離物中含有DHAV-1和DHAV-3的分離病毒。結(jié)果表明，構(gòu)建的DHAV二重RT-PCR檢測(cè)方法與病毒分離鑒定結(jié)果具有高度一致性。

3討論

近年來，隨著國內(nèi)DHAV-3的出現(xiàn)，DHAV-1和DHAV-3在部分地區(qū)共流行，同時(shí)DHAV-1和DHAV-3的流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化相似，這些均給國內(nèi)鴨甲型肝炎的預(yù)防和診斷帶來了困難［5］，有關(guān)RT-PCR檢測(cè)方法的研究報(bào)道較多，但同時(shí)檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3的二重RT-PCR的相關(guān)報(bào)道甚少［6，7］。Kim等［8］建立的DHAV-1和新型鴨肝炎的多重RT-PCR方法［8］，檢測(cè)方法采用韓國當(dāng)?shù)亓餍卸局辍？紤]不同地區(qū)的地域性差異，因此適宜采用國內(nèi)流行毒株作為鑒別診斷。黃秋雪等［6］建立的DHAV二重RT-PCR方法，雖具有良好的特異性和敏感性，但擴(kuò)增出DHAV-A（259 bp 194 bp）的特異片段大小相近，臨床檢測(cè)結(jié)果判定過程難以區(qū)分，容易誤判。本研究建立的二重RT-PCR檢測(cè)方法，NDV、NDRV、DTMUV、DPV均未擴(kuò)增出條帶，說明該方法具有良好的特異性；敏感性試驗(yàn)表明，對(duì)DHAV-1和DHAV-3檢測(cè)的敏感度也較高。對(duì)臨床樣品的病毒鑒定結(jié)果顯示，本研究建立的方法與病毒分離鑒定結(jié)果具有高度一致性。因此，本研究建立的DHAV-1和DHAV-3的二重RT-PCR方法，具有良好的特異性和較高的敏感度，可以直接用于臨床樣品的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，為臨床上鴨肝炎的鑒別診斷和病原檢測(cè)提供了快速適用的手段。

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DEVELOPMENT OF A DUPLEX RT-PCR ASSAY FOR DETECTION OF DUCK HEPATITIS A VIRUS SEROTYPES 1 AND 3

LI Hua-dong1，2， HUANG Xian-ming2， LU Feng-ying2， DING Mei-juan2， ZHANG Xiao-fei2
（1. College of Animal Science Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei 230061，China；2. Nanjing Tech-bank Bio-industry Co.， LTD， Nanjing 211102， China）

Two pairs of specifi c primers were designed based on the sequences of Duck hepatitis A virus （DHAV）， and single PCR assays were firstly developed for Duck hepatitis A virus serotype 1（DHAV-1） and serotype 3（DHAV-3）， respectively. After optimization of amplifi cation conditions， a duplex PCR method was then developed for differentiating DHAV-1 and DHAV-3. In the duplex PCR assay，the fragments of 751 bp for DHAV-1 and 448 bp for DHAV-3 were simultaneously amplifi ed from the mixed positive samples whereas no PCR products were amplifi ed from other virus samples， indicating its specifi city for DHAV. The sensitivity assay results showed that the lowest detection limits was 10 pg/μL for DHAV-1 and 8 pg/μL for DHAV-3. Therefore， the duplex RT-PCR assay would be used as an effective tool for diagnosis of DHAV-1 and DHAV-3.

Duck hepatitis A virus serotype 1 （DHAV-1）； DHAV-3； duplex RT-PCR

S852.659.6

A

1674-6422（2015）05-0032-04

2015-08-04

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)資金項(xiàng)目（BA2010021）

李化東，男，碩士研究生，主要從事禽病防控研究

張小飛，E-mail∶ xiaofei0804@sina.com