許 瑞，趙登云，洪 煬，陸 珂，李 浩，林矯矯，2，馮金濤，徐玉梅，朱傳剛

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國家防治動(dòng)物血吸蟲病專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；3. 上海徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031）

鏈球菌蛋白G的結(jié)構(gòu)域重構(gòu)、表達(dá)及鑒定

許 瑞1，趙登云1，洪 煬1，陸 珂1，李 浩1，林矯矯1，2，馮金濤1，徐玉梅3，朱傳剛1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國家防治動(dòng)物血吸蟲病專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；3. 上海徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031）

鏈球菌蛋白G（streptococcal protein G， SPG）具有與多種動(dòng)物IgG結(jié)合的特性。本研究對鏈球菌蛋白G進(jìn)行生物學(xué)分析，設(shè)計(jì)重組蛋白G的基因序列，構(gòu)建重組蛋白G的原核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白，通過GST親和層析純化蛋白。Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白具備與IgG結(jié)合的能力。ELISA測定重組蛋白與牛、山羊、兔、鼠4個(gè)物種IgG的親和力，顯示重組蛋白G的親和力普遍高于商品化鏈球菌蛋白G。本研究成功重構(gòu)并表達(dá)、純化了鏈球菌重組蛋白G，得到其與4個(gè)物種抗體IgG的親和力常數(shù)，有助于SPG在其他相關(guān)研究中的應(yīng)用。

鏈球菌蛋白G；重組；親和力常數(shù)

鏈球菌蛋白G（streptococcal protein G，SPG）是一種能與人及多種動(dòng)物IgG結(jié)合的鏈球菌細(xì)胞壁蛋白，最早在1973年由Kronvall報(bào)道。A、C、G群鏈球菌的細(xì)胞壁及培養(yǎng)上清均含該蛋白，且其特性與葡萄球菌蛋白A（SPA）明顯不同。1984年，Bjorck等［1］將這種蛋白統(tǒng)稱為鏈球菌蛋白G，并對其進(jìn)行了分離純化。目前，SPA由于具有與抗體Fc端結(jié)合的特性，較為廣泛的應(yīng)用于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，而SPG與SPA相比，IgG的結(jié)合力更強(qiáng)，結(jié)合譜更廣［2］。

SPG的結(jié)構(gòu)如圖1所示，從N端開始有三個(gè)同源結(jié)構(gòu)A1、A2和A3，每個(gè)同源結(jié)構(gòu)由24個(gè)氨基酸組成，同時(shí)這三個(gè)同源結(jié)構(gòu)被51個(gè)氨基酸的同源區(qū)域B1、B2隔開，接著是一個(gè)間隔區(qū)S，隨后是55個(gè)氨基酸的同源結(jié)構(gòu)C1、C2和C3，它們之間又被D1和D2區(qū)隔開，C3區(qū)之后為親水區(qū)W，最后為M區(qū)［3］。研究表明，SPG三個(gè)同源的氨基酸序列C1、C2和C3區(qū)與IgG Fc端的結(jié)合有關(guān)，且C1和C2只有2個(gè)氨基酸序列不同，C1和C3區(qū)有6個(gè)氨基酸序列不同，且C3結(jié)構(gòu)與IgG的結(jié)合能力相當(dāng)于C1結(jié)構(gòu)的7倍［4］。

為獲得一種能高效結(jié)合IgG的工具蛋白，本研究將SPG基因的IgG結(jié)合片段進(jìn)行重構(gòu)，只保留蛋白與IgG的Fc端特異性結(jié)合的C區(qū)，并探討該重組蛋白G結(jié)合不同物種IgG的生物學(xué)活性。

圖1 鏈球菌蛋白G氨基酸序列結(jié)構(gòu)［3］Fig.1 The amino acid of SPG sequences

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種 E.coli BL21購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pGEX-2T為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 相關(guān)試劑 ProteinRuler II（12-120 kDa）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；可溶性單組分TMB底物溶液、HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購自Whatman公司；對照用商品化鏈球菌蛋白G（SPG）購自杭州紐龍生物科技有限公司。檢測結(jié)合力的四種酶標(biāo)抗體：?？剐∈驣gG-HRP購自Santa Cruz Biotechnology；山羊抗小鼠IgG-HRP購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；小鼠抗兔IgG-HRP購自Proteintech；兔抗雞IgG-HRP購自上海中科英沐生物科技有限公司。

1.3 重組蛋白G的構(gòu)建 從GenBank中查出已公布的編碼SPG的C區(qū)，找出C1、C2、C3區(qū)和D區(qū)，并將C1、C2區(qū)替換為C3區(qū)，得到C3DC3DC3的基因序列，檢測基因序列中是否含有大腸桿菌使用頻率低的（＜10%）稀有密碼子，將其替換為編碼同一氨基酸的大腸桿菌偏愛密碼子，替換后在其3'端添加TAA終止序列，合成設(shè)計(jì)重組蛋白G的基因片段。根據(jù)質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)含BamH1（GGATCC）和EcoR1（GAATTC）兩個(gè)酶切位點(diǎn)的引物。上游引物：5'-GCGGATCCACTTACAAACTGA-3'，下游引物：5'-GCGAATTCTTATTCAGTTACCG-3'。PCR擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；92℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增的目的基因用雙酶切連接法克隆至原核表達(dá)載體pGEX-2T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α后挑菌抽取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測序鑒定。

1.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落鑒定后，接種于含50 μg/mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 將誘導(dǎo)后的菌液12 000×g離心30 min，收集沉淀，用1×PBS重懸，反復(fù)凍融3次后，冰浴超聲破碎20 min后離心，收集上清，沉淀用8 mol/L尿素重懸，離心后收集上清。

1.6 重組蛋白G的純化 使用GST親和層析柱對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，收集各段洗脫液樣品。

1.7 Western blot檢測重組蛋白G與IgG的結(jié)合活性將純化后的帶有GST標(biāo)簽的重組蛋白G（rSPG）進(jìn)行SDS-PAGE電泳之后，電轉(zhuǎn)移至NC膜，進(jìn)行Western blot。用1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為抗體，HRP-DAB底物顯色溶液進(jìn)行顯色。

1.8 ELISA法測定重組蛋白G與不同物種IgG親和常數(shù) 用BCA法測定rSPG的濃度，并用商品化的標(biāo)準(zhǔn)蛋白G（SPG）作為對照。用包被液將蛋白從10 μg/mL 開始進(jìn)行倍比稀釋，共8個(gè)稀釋度，以100 μL/孔包被96孔板上，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，4℃過夜；PBST洗滌后，用5%脫脂奶粉的PBST溶液（150 μL/）孔，37℃封閉2 h；PBST洗滌，將山羊抗鼠、?？故?、牛抗兔、兔抗雞這4種二抗，分別按1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000進(jìn)行倍比稀釋，每孔加入100 μL，37℃孵育2 h；PBST洗滌后，TMB顯色，室溫反應(yīng)15 min，2 mol/L H2SO4終止，讀取OD450值。用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行擬合曲線，并帶入公式：K=（n-1）/（n［Ab］T'-［Ab］T），求出親和常數(shù)K值。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白G的原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 鏈球菌蛋白G的C區(qū)基因序列含有C1、C2、C3三個(gè)同源區(qū)（圖2A），將C1、C2區(qū)的基因序列替換為C3區(qū)，重構(gòu)后的蛋白G序列如圖2B所示。DNAStar分析表明該基因編碼195個(gè)氨基酸，理論分子量為21.22 kDa，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為4.63。構(gòu)建重組蛋白G的原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定（圖3），測序結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)序列一致，目的基因大小約為600 bp。

圖2 重構(gòu)的鏈球菌蛋白G C區(qū)序列Fig.2 Reconstruction of the C domain sequences of streptococcal protein G（SPG）

圖3 原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T-rSPG的鑒定Fig.3 Identifi ed the recombinant plasmid pGEX-2T-rSPG

2.2 重組蛋白G的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性鑒定 SDSPAGE分析顯示，pGEX-2T-G重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)，誘導(dǎo)6 h后表達(dá)量達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定。帶有GST標(biāo)簽后的重組蛋白G含有422個(gè)氨基酸，理論分子量為47.51 kDa，SDS-PAGE顯示rSPG分子量約為48 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符，該重組蛋白為水溶性蛋白，屬于可溶性表達(dá)，未形成包涵體（圖4）。

圖4 SDS-PAGE分析pGEX-2T-rSPG表達(dá)情況Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression of pGEX-2T-rSPG in E.coil

2.3 重組蛋白G的純化 重組蛋白帶有GST標(biāo)簽，采用GST親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE分析，獲得較純的目的蛋白rSPG（圖5）。

圖5 重組蛋白G SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE anlaysis of the purifi cation of rSPG

2.4 重組蛋白G與IgG結(jié)合活力測定 Western blot檢測rSPG與1∶2000稀釋的抗體反應(yīng)活性，可以觀察到在48 kDa呈現(xiàn)出識(shí)別條帶，證明rSPG具有與IgG結(jié)合的能力（圖6）。

圖6 重組蛋白G的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of the purifi ed rSPG

2.5 與不同物種IgG親和常數(shù)測定 將純化后的rSPG和作為對照的商品化蛋白G（SPG）測定濃度后，用不同濃度的rSPG和SPG分別包被平板用做抗原，將倍比稀釋的不同濃度的抗體加入平板中與抗原相結(jié)合。以測得的OD450值為縱坐標(biāo)，以抗原濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)進(jìn)行曲線擬合，結(jié)果如圖7所示。根據(jù)擬合的曲線帶入公式分別計(jì)算親和常數(shù)K，將得到幾個(gè)不同的K值并取其平均數(shù)，得到了rSPG和SPG的親和常數(shù)值，結(jié)果見表1。

圖7 重組蛋白G與不同物種IgG親和常數(shù)測定Fig.7 Determination of affi nity constant of rSPG with IgG from different species

表1 兩種鏈球菌蛋白G的親和常數(shù)Table 1 Affi nity constants of the rSPG and SPG

3 討論

SPG有與多種動(dòng)物IgG結(jié)合的特性，且與SPA相比有更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣泛的結(jié)合譜，并且不會(huì)和IgM、IgD或IgA結(jié)合，因此SPG展現(xiàn)出了更強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。SPG含有與IgG的Fab段以及人血清白蛋白（HSA）結(jié)合的A、B區(qū)，與抗體IgG的Fab片段結(jié)合可影響抗體與抗原的正常結(jié)合，與HSA結(jié)合可能造成檢測的假陽性，因此，本研究將SPG的C區(qū)進(jìn)行重構(gòu)，以減少非特異性的結(jié)合或交叉反應(yīng)。在重構(gòu)時(shí)，僅保留SPG與IgG的Fc端特異性結(jié)合的C區(qū)，考慮到C3區(qū)與Fc端的結(jié)合力高于C1、C2區(qū)，所以將C1、C2區(qū)用C3區(qū)替換，獲得一個(gè)含C3DC3DC3結(jié)構(gòu)域的重組基因。檢測結(jié)果顯示，這種重構(gòu)方式提高了重組蛋白G與不同物種IgG的結(jié)合能力。

根據(jù)Li等［5］的觀點(diǎn)，使用頻率低于10% 的密碼子被定義為稀有密碼子，若外源基因中含有大量的稀有密碼子，會(huì)造成蛋白低表達(dá)甚至不表達(dá)，故對SPG的C區(qū)片段含有的20個(gè)稀有密碼子進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過優(yōu)化后，重組蛋白在大腸桿菌中高含量表達(dá)，且重組蛋白以可溶性蛋白存在于細(xì)菌中，占細(xì)菌總蛋白的20%。

在目前的研究中，親和標(biāo)簽已經(jīng)成為了蛋白純化的一個(gè)重要的工具，本研究選用了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽（GST-tag）。有大量的實(shí)驗(yàn)表明，外源蛋白在大腸桿菌表達(dá)體系中過量的表達(dá)常會(huì)以包涵體形式存在，而GST標(biāo)簽可以在一定程度上增大重組蛋白的可溶性，有助于后續(xù)的蛋白純化［6］。除此之外，在本研究中，因?yàn)槟康牡鞍追肿恿枯^小，GST標(biāo)簽還可以加大分子量，調(diào)節(jié)重組蛋白的等電點(diǎn)，有利于進(jìn)行其他后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

親和常數(shù)可以表示分子間相互作用的強(qiáng)度，是對分子之間相互作用最本質(zhì)的描述。某兩個(gè)蛋白相互作用的親和常數(shù)越大，說明這兩個(gè)蛋白的親和力越大。高親和力的抗體對于定量檢測及導(dǎo)向診治有幫助，而低親和力的抗體用于免疫純化較合適。親和力的大小可以通過親和常數(shù)Ka（或反應(yīng)的平衡常數(shù)）來表示，即：

表示抗原抗體復(fù)合物的濃度，［Ag］表示抗原的濃度，［Ab］表示抗體的濃度。本研究首先通過Western blot檢測證實(shí)rSPG能與抗體IgG結(jié)合。然后通過ELISA法代入公式得到rSPG、商品化蛋白G（SPG）與IgG的親和常數(shù)，結(jié)果顯示與SPG相比，rSPG與牛和山羊的IgG抗體結(jié)合能力更強(qiáng)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另外，rSPG與兔、鼠IgG的親和力也高于商品化蛋白G。

鏈球菌蛋白G由于具有廣泛的與不同物種抗體IgG特異性結(jié)合的特性，目前在應(yīng)用方面已經(jīng)顯示出了巨大的潛力，主要應(yīng)用于免疫學(xué)和免疫化學(xué)方面。在ELISA方面，SPG可替代二抗，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、用量少的特點(diǎn)，并且可以很好的替代SPA［7］。裴福全等［8］使用辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈球菌蛋白G作為快速ELISA的酶標(biāo)二抗，檢測人血清中的華支睪吸蟲特異性抗體，顯示出了高度的特異性和敏感性。在親合層析時(shí)，SPG還可以與Sepharose結(jié)合，組裝成親合層析柱，用于分離純化各種IgG；同時(shí)，用SPG制備固相抗體用于放射分析，顯示出SPG是一種良好的固相抗體制備介質(zhì)［9］。在膠體金免疫層析方面，Bendayan等［10］將SPG與膠體金結(jié)合，再復(fù)合多種單克隆或多克隆抗體，用來定位各種抗原位點(diǎn)，結(jié)果顯示，金標(biāo)SPG對各種受試哺乳動(dòng)物的抗體都能穩(wěn)定結(jié)合。因此，SPG-膠體金是細(xì)胞免疫化學(xué)上一種更好的多功能高分辨率探針。此外，F(xiàn)owler等［11］將特異性的抗體錨定于硫醇鹽化的重組SPG支架上，作為電化學(xué)免疫感受器的一部分，用來高效捕獲被分析物，也取得了良好的效果。

本研究成功獲得了重組鏈球菌蛋白G，不但保留了鏈球菌蛋白G能與IgG特異性結(jié)合的特性，而且在此基礎(chǔ)上又提高了其與IgG的結(jié)合力，是一個(gè)很好的標(biāo)記抗體的工具，可以在其他相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。

［1］Bjorck L， Kronvall G. Purification and some properties of streptococcal protein G，a novel IgG-binding reagent［J］. J Immunol， 1984， 133（2）∶ 969-974.

［2］曹之舫. 鏈球菌蛋白 G—一種優(yōu)于葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合物［J］. 國外醫(yī)學(xué)微生物學(xué)分冊， 1989， 12（5）∶ 213-215， 225.

［3］Sjobring U， Bjorck L， Kastern W， et al. Streptococcal Protein G， gene structure and protein binding properties［J］. J Biol Chem， 1991， 266（1）∶ 399-405.

［4］Kobatake E， Nishimori Y， Ikariyama Y， et al. Application of a fusion protein， metapyrocatechase/protein A， to an enzyme immunoassay［J］. Anal Biochem， 1990， 186（1）∶14-18.

［5］Li A， Kato Z， Ohnishi H， et al. Optimized gene synthesis and high expression of human interleukin-18［J］. Protein Expr Purif， 2003， 32（1）∶ 110-118.

［6］陳愛春， 彭偉， 汪生鵬. 親和標(biāo)簽在重組蛋白表達(dá)純化中的應(yīng)用［J］. 中國生物工程雜志， 2012， 32（12）∶ 93-103.

［7］靳曉紅， 初曉翠， 孫長柱. 鏈球菌G蛋白的特性及應(yīng)用前景［J］. 上海免疫學(xué)雜志， 1997， 17（2）∶ 121-125.

［8］裴福全， 崔惠兒， 方悅怡， 等. 鏈球菌蛋白G-ELISA用于華支睪吸蟲病診斷的方法初探［J］. 華南預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2007，33（6）∶ 37， 42.

［9］高云朝， 吳洪芳， 秦成生. 鏈球菌蛋白G在固相放射免疫分析中的應(yīng)用［J］. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志， 2000，20（6）∶ 601.

［10］Bendayan M， Garzon S. Protein G-gold complex∶comparative evaluation with protein A-gold for highresolution immunocytochemistry［J］. J Histochem Cytochem， 1988， 36（6）∶ 597-607.

［11］Fowler J M， Stuart M C， Wong D K. Comparative study of thiolated Protein G scaffolds and signal antibody conjugates in the development of electrochemical immunosensors［J］. Biosens Bioelectron， 2007， 23（5）∶633-639.

RECONSTRUCTION， EXPRESSION AND IDENTIFICATION OF A STREPTOCOCCAL PROTEIN G DOMAIN

XU Rui1， ZHAO Deng-yun1， HONG Yang1， LU Ke1， LI Hao1， LIN Jiao-jiao1，2， FENG Jin-tao1，XU Yu-mei3， ZHU Chuan-gang1
（1. Natural Laboratory of Animal Schistosomiasis Control， Key Laboratory for Animal Parasitology， Ministry of Agriculture， Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009， China； 3. Shanghai Xuhui Central Hospital， Shanghai 200031， China）

Streptococcal protein G can bind to Fc domain of IgG of many species. This function has been widely applied in immunological experiments. In the present study， the genetic fragment coding for streptococcal protein G （SPG） was subcloned into pGEX-2T and then GST-taggged fusion protein was expressed in Escherichia coli BL21 cells. The recombinant SPG （rSPG） showed the ability to bind with IgG in Western blot and even higher affi nity for IgG of four animal species （cattle， goats， rabbits and mice）in ELISA than commercially available SPG. The results demonstrated that the rSPG was an excellent tool for the usage in IgG related studies.

Streptococcal protein G； reconstruction； affi nity

S852.616

A

1674-6422（2015）05-0046-07

2015-07-15

許瑞，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

朱傳剛，E-mail： zcg@shvri.ac.cn