蔡秀清，劉丹丹，宿世杰，王樂樂，賈傳禮，許金俊，陶建平

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的構(gòu)建

蔡秀清，劉丹丹，宿世杰，王樂樂，賈傳禮，許金俊，陶建平

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

本文采用Trizol試劑提取毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA，用oliogo（dT）磁珠法純化mRNA后，采用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA噬菌體表達(dá)文庫。經(jīng)鑒定，原始文庫容量為2.14×106pfu/mL，擴(kuò)增后的文庫容量為4.47×1010pfu/mL，擴(kuò)增文庫的重組率為90%。隨機(jī)挑取100個單克隆，通過菌液PCR檢測得知文庫插入片段長度以400～1000 bp為主。本研究結(jié)果為毒害艾美耳球蟲新基因的篩選和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

毒害艾美耳球蟲；第二代裂殖子；cDNA文庫

雞球蟲病是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的寄生性原蟲病，世界所公認(rèn)的病原有7種。臨床上，大多數(shù)蟲種主要危害3～6周齡的雛雞，而毒害艾美耳球蟲（Eimeria necatrix）常危害8～18周齡的雞，引起雞的急性小腸球蟲?。?］。目前，雞球蟲病的防治主要依賴化學(xué)藥物或雞球蟲病活疫苗，雖然人們采取了穿梭用藥、輪換用藥、聯(lián)合用藥等各種措施，但球蟲幾乎對所有使用過的抗球蟲藥物均出現(xiàn)了耐藥性。雞球蟲病活疫苗有著較強(qiáng)的免疫效果，但存在一些突出的問題，如有擴(kuò)散病原的風(fēng)險，疫苗接種劑量難以控制，影響飼料報酬等［2，3］。因此，雞球蟲保護(hù)性抗原基因的分離鑒定以及基因工程疫苗的研究一直是雞球蟲病研究的熱點。

艾美耳球蟲的生活史包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三個發(fā)育階段，其中裂殖生殖又經(jīng)歷2～3代［1］。球蟲的抗原不僅具有種特異性，還有蟲體發(fā)育階段特異性。研究顯示，毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖生殖階段對再感染能產(chǎn)生最強(qiáng)的抵抗力［4］。因此，分離鑒定毒害艾美耳球蟲第二代裂殖生殖階段的功能性抗原基因顯得尤為重要。

cDNA文庫是以特定組織或細(xì)胞的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成的互補(bǔ)DNA與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化受體菌形成的重組DNA克隆群。它可以特異地反映某種組織或細(xì)胞在特定發(fā)育階段表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)以及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢［5］。Tajima等［6］利用雞陽性血清從毒害艾美耳球蟲裂殖子cDNA中篩選出一個與柔嫩艾美耳球蟲基因（Mzp5-7）同源的pNP19基因，其體外表達(dá)的重組蛋白能特異性識別毒害艾美耳球蟲致弱株或強(qiáng)毒株免疫的雞血清。卞慶松等［7］成功構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫。本研究利用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子階段的cDNA文庫，為篩選該蟲種的功能性基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株 毒害艾美耳球蟲揚(yáng)州株由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室建株并保存。試驗前經(jīng)雞體傳代復(fù)壯。

1.2 實驗動物 黃羽雞購自中國農(nóng)科院家禽研究所育種中心，雛雞出殼后即運(yùn)回實驗室，飼養(yǎng)在無球蟲環(huán)境中，自由采食和飲水。

1.3 主要試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司；SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒購自Clontech公司；GigapackⅢ Gold Packaging Extract購自TaKaRa公司；mRNA分離試劑盒購自TaKaRa公司；1 kb DNA Marker、DL2000 DNA Marker購自Fermentas公司；其他所用試劑均購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4 第二代裂殖子的分離與純化 28日齡無球蟲雛雞，每羽雞經(jīng)嗉囊感染20 000個毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊。感染后150 h剖檢，取小腸中段，按文獻(xiàn)［8］報道的方法分離純化裂殖子。

1.5 第二代裂殖子總RNA提取與mRNA的分離與純化 將凍存于液氮中的毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子迅速取出100 μL（約108個裂殖子），加入1 mL Trizol試劑，置于勻漿器中勻漿后，按Trizol試劑說明書提取總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后，用Nanodrop-2000紫外分光光度計測定其含量和純度。按TaKaRa公司mRNA試劑盒說明書分離純化mRNA，用1%瓊脂糖凝膠變性電泳進(jìn)行檢測其狀況。

1.6 cDNA文庫的構(gòu)建

1.6.1 第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成 總體系為10 μL：模板mRNA 3 μL、SMART IVTM寡核苷酸引物1 μL、CDSⅢ3'引物1 μL。72℃孵育2 min后，迅速冰浴2 min，再加入第一鏈反應(yīng)物Power ScriptTM反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、10 mmol/L dNTP混合液1 μL、20 mmol/ L DTT 1 μL、5×第一鏈合成緩沖液2 μL?；靹蚝?2℃ 1 h后置冰上5 min終止反應(yīng)。

1.6.2 第二鏈cDNA的LD-PCR合成 總體系為100 μL：第一鏈cDNA反應(yīng)產(chǎn)物2 μL、去離子水80 μL、10×Advantage PCR buffer 10 μL、50×dNTP Mix 2 μL、5' PCR Primer 2 μL、3' PCR Primer 2 μL、50×Advantage Polymerase Mix 2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，68℃退火6 min，30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.3 蛋白酶K的消化 取50 μL第二鏈cDNA（約2～3μg），按照說明書進(jìn)行蛋白酶K的消化。加入79 μL去離子水溶解沉淀，進(jìn)行下一步實驗，或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.4 SfiⅠ酶切消化 總體系為100 μL：cDNA 79 μL、10×SfiⅠBuffer 10 μL、SfiⅠEnzyme 10 μL、100×BSA 1 μL。50℃水浴2 h，然后加入2 μL 1%的二甲苯氰藍(lán)，混勻備用。

1.6.5 cDNA的分離純化 將上述SfiⅠ酶切消化后的cDNA（100 μL）全部上樣于CHROMA SPIN-400TM柱，每管1滴（約35 μL），每管取5 μL收集液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠變性電泳，150V電泳10 min，檢測各管片段的大小，收集出現(xiàn)DNA片段的前3管約含140μL的cDNA片段，純化回收后，加入7 μL去離子水溶解，用于載體連接。

1.6.6 cDNA與λTriplEx2載體連接與體外包裝 以體積比為1.5∶1的體系加入cDNA和λTriplEx2TM載體，16℃連接過夜。然后取4 μL連接產(chǎn)物與1管包裝蛋白混合，22℃水浴2 h，加入500 μL SM buffer和20 μL氯仿，溫和混勻，收集含有噬菌體的上清，即為構(gòu)建的cDNA原始文庫。

1.7 cDNA文庫的鑒定

1.7.1 初始cDNA文庫容量的測定 取初始cDNA文庫1μL分別作1∶10、1∶100、1∶1000稀釋，然后各取1 μL稀釋液加至200 μL過夜培養(yǎng)的XL1-BLUE懸液中，37℃吸附10～15 min，再加入2 mL LB Top agar（45℃左右）混勻鋪平板，37℃培養(yǎng)過夜，d2計算平板上的噬菌斑。文庫滴度（pfu/mL）=（噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×103μL/mL）/涂板噬菌體體積（μL）。

1.7.2 cDNA文庫的擴(kuò)增和效價測定 將原始文庫在直徑為150 mm LB/MgSO4培養(yǎng)基平板上擴(kuò)增，37℃培養(yǎng)6～18 h，避免噬菌體的污染。每個平板加12 mL 1×Lambda dilution buffer，4℃保存過夜。收集噬菌體液體，加入10 mL氯仿，混勻后離心，收集上清備用。如果長期保存可加入7%的DMSO，-70℃保存，避免反復(fù)凍融。將擴(kuò)增的cDNA文庫按梯度平鋪于90 mm的LB/MgSO4平板上，計算噬菌斑的個數(shù)，方法同上。

1.7.3 cDNA文庫插入片段大小及重組率的測定 隨機(jī)挑取擴(kuò)增文庫上的100個噬菌斑，置于0.5 mL離心管中，加入50 μL 1×Lambda dilution buffer和2 μL氯仿，4℃過夜。進(jìn)行PCR檢測。上游引物為：5'-TCCGAGATCTGGACGAGC-3'；下游引物為：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 13.5 μL、10×PCR buffer 2 μL、上游引物（25μmol/mL）0.75 μL、下游引物（25μmol/mL）0.75 μL、2.5 mmol/L的 dNTP 1.5 μL 、TaKaRa rTaq 0.5 μL、噬菌斑模板1 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54.5℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段大小和重組率。

2 結(jié)果

2.1 毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子的分離與純化 從50羽雞的小腸中段卵黃蒂前后黏膜中純化裂殖子，通過酶消化，離心洗滌，紅細(xì)胞裂解和Percoll密度梯度離心后得到2 mL沉淀物，經(jīng)顯微鏡觀察，裂殖子活性好，形態(tài)完整，無雜質(zhì)（圖1）。

圖1 純化的毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子Fig.1 The second generation merozoites of E. necatrix

2.2 第二代裂殖子總RNA的提取和mRNA的分離 提取的毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA，經(jīng)Nanodrop-2000紫外分光光度計測定其OD260/ OD280=2.12，含量為3817.2 ng/μL。電泳檢測顯示，可見明顯的28 S、18 S條帶（圖2），由總RNA分離得到的mRNA經(jīng)變性電泳檢測，可看到分布在250～2500 bp之間的一片模糊的條帶（圖3），用Nanodrop-2000紫外分光光度計測定其濃度為50 ng/μL。

2.3 雙鏈cDNA的合成 合成的雙鏈cDNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示cDNA的大小集中在250～1000 bp（圖4），符合cDNA合成的分布規(guī)律。

2.4 cDNA文庫的鑒定 經(jīng)計算，原始文庫容量（pfu/ mL）=［214（噬菌斑數(shù)）×10（稀釋倍數(shù)）×103μL/ mL］/1μL（涂板噬菌體體積）=2.14×106pfu/ mL，擴(kuò)增后的文庫容量（pfu/mL）=4.47（噬菌斑數(shù)）×106（稀釋倍數(shù)）×103μL/mL/10 μL（涂板噬菌體體積）=4.47×1010pfu/ mL。電泳和片段大小統(tǒng)計結(jié)果表明擴(kuò)增文庫的重組率為90%，插入片段集中在400～1000 bp（圖5）。

M： DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL1000）； 1： 毒害艾美耳球蟲總RNAM： DNA Marker（DL1000）； 1： Total RNA of E. necatrix

M： DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL1000）； 1： 分離的mRNAM： DNA Marker（DL1000）； 1： mRNA products

3討論

在cDNA文庫的構(gòu)建中，總RNA和mRNA的質(zhì)量是實驗成功的先決條件。目前，提取總RNA的方法主要有氯化銫離心法、Trizol法、異硫氰酸胍等方法［9，10］。本研究采用Trizol法提取總RNA，結(jié)果顯示提取物在1%瓊脂糖凝膠變性電泳時28 S、18 S條帶清晰，無拖帶現(xiàn)象，產(chǎn)量高達(dá)3817.2 ng/μL，其OD260/OD280比值大于2.0，表明提取的總RNA純度高，基本無蛋白和其他雜質(zhì)污染。從總RNA中分離純化的mRNA，經(jīng)檢測在250～2500 bp看到一條模糊的條帶，表明mRNA的質(zhì)量符合有效文庫的標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)一般文庫的構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)：未擴(kuò)增文庫滴度達(dá)1.0×106pfu/mL，試劑盒所提供的對照片段重組率達(dá)80%以上，所建文庫即為有效文庫。本研究用SMART方法構(gòu)建的毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫，經(jīng)檢測原始文庫的容量為2.14×106pfu/ mL，擴(kuò)增后的文庫容量為4.47×1010pfu/mL，擴(kuò)增文庫重組率為90%，通過隨機(jī)PCR擴(kuò)增得知插入片段大小在400 ～1000 bp內(nèi)，達(dá)到SMART有效文庫的構(gòu)建指標(biāo)。

目前，國內(nèi)外已成功構(gòu)建了多個雞球蟲的cDNA文庫［11-14］，并從文庫中篩選出了目的片段或基因。卞慶松等［7］構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA文庫，并利用免疫學(xué)方法，或?qū)⒄麄€文庫轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒文庫，成功地篩選出了基因片段。Binger等［15］用兔抗柔嫩艾美耳球蟲裂殖子表面抗體，從文庫中篩選出了λMZ5-7片段。Brothers等［16］利用抗體篩選出柔嫩艾美耳球蟲Ta4基因片段，并克隆出該基因的全長序列。Refega等［17］從柔嫩艾美耳球蟲第一代裂殖體和子孢子文庫中篩選到的陽性克隆，經(jīng)鑒定為熱休克蛋白、核糖體蛋白和丙酮酸激酶基因。迄今為止，毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的研究僅見Tajima等［6］相關(guān)報道，因此本文庫的成功構(gòu)建將為篩選新基因和研究毒害艾美耳球蟲基因工程疫苗提供新的研究思路。

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CONSTRUCTION OF A CDNA LIBRARY FOR THE SECOND GENERATION OF MEROZOITES OF EIMERIA NECATRIX

CAI Xiu-qing， LIU Dan-dan， SU Shi-jie， WANG Le-le， JIA Chuan-li， XU Jin-jun， TAO Jian-ping
（Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

In order to construct a cDNA library for the second generation of merozoites of Eimeria necatrix， the whole RNA was extracted using Trizol reagent and the mRNA was purified using the beads with oligo（dT）. Then， the cDNA library was constructed based on SMART technique. The results showed that the capacity of the unamplifi ed library was 2.14×106pfu/mL and the capacity of the amplifi ed library was 4.47×1010pfu/mL. The amplifi ed library recombination rate was 90%. According to the PCR amplifi cation from 100 monoclonal colonies that were picked randomly， the sizes of amplifi ed fragments were mostly between 400 bp to 1000 bp. The cDNA library constructed in the present study provided a basis for screening， cloning and further studies of new genes of E. necatrix.

Eimeria necatrix； merozoites； cDNA library

S852.723

A

1674-6422（2015）05-0065-05

2015-06-04

國家自然科學(xué)基金（31472181）；江蘇省屬高校自然科學(xué)基金重大項目（11KJA230002）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20123250110002）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目；中央財政支持地方高校發(fā)展項目

蔡秀清，女，碩士，主要從事獸醫(yī)寄生蟲與寄生蟲病學(xué)研究

陶建平，E-mail：yzjptao@126.com