王繼權(quán)，趙興長(zhǎng)，孫平，李昊天，褚鑫，呂剛，范仲凱

依達(dá)拉奉抗大鼠脊髓損傷后脊髓細(xì)胞凋亡的機(jī)制初探

王繼權(quán)，趙興長(zhǎng)，孫平，李昊天，褚鑫，呂剛，范仲凱△

目的探討依達(dá)拉奉（EDA）對(duì)大鼠脊髓損傷（SCI）后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。方法36只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組、SCI組、EDA組，每組12只。采用Allen's法建立SCI模型，sham組僅行椎板切除術(shù)。術(shù)后Sham組和SCI組給予與EDA組等體積等頻次生理鹽水處理；EDA組在SCI模型建成以后予以EDA（10 mg/kg），每12 h腹腔注射給藥1次。于術(shù)后3 d取脊髓，應(yīng)用Western blot檢測(cè)C/EBP同源蛋白（CHOP）、Cleaved caspase-12和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)脊髓組織中caspase-12、CHOP陽性細(xì)胞的比率，TUNEL法檢測(cè)脊髓細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果SCI組較sham組CHOP、Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-3的表達(dá)升高，Cleaved caspase-12、CHOP陽性細(xì)胞比率增加，脊髓組織細(xì)胞凋亡比率增加（均P＜0.01）。EDA組較SCI組CHOP、Cleaved caspase-12和Cleaved caspase-3的表達(dá)降低，Cleaved caspase-12、CHOP陽性細(xì)胞比率減少，脊髓組織細(xì)胞凋亡比率減少（均P＜0.01）。結(jié)論EDA對(duì)脊髓損傷有保護(hù)作用，機(jī)制可能與其抑制SCI后脊髓細(xì)胞的ERS和脊髓細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

脊髓損傷；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12；模型，動(dòng)物；大鼠，Sprague-Dawley；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；依達(dá)拉奉；轉(zhuǎn)錄因子CHOP

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，后者包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、損傷局部水腫、神經(jīng)興奮性中毒、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等［1］，可導(dǎo)致永久性神經(jīng)功能缺陷［2］。目前，對(duì)于繼發(fā)性損傷的機(jī)制和阻斷方式的研究成為熱點(diǎn)。依達(dá)拉奉（EDA）是臨床廣泛用于治療腦卒中的藥物。有研究顯示，EDA對(duì)糖尿病中風(fēng)鼠的腦神經(jīng)具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其可抑制腦神經(jīng)細(xì)胞ERS有關(guān)［3］。有研究表明，EDA對(duì)SCI亦具有保護(hù)作用［4］。施旺細(xì)胞移植聯(lián)合EDA注射可促進(jìn)脊髓損傷后大鼠神經(jīng)纖維再生及神經(jīng)功能改善［5］。但關(guān)于EDA對(duì)SCI的保護(hù)機(jī)制及對(duì)SCI后的ERS是否具有抑制作用報(bào)道少見。本研究通過檢測(cè)EDA對(duì)SCI后CHOP、caspase-12和caspase-3的表達(dá)和脊髓細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討EDA對(duì)SCI后的脊髓細(xì)胞保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料SPF級(jí)SD大鼠36只，體質(zhì)量220～250 g，雌雄各半，由遼寧醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（sham）組、SCI模型組及EDA組，每組12只。每組大鼠再隨機(jī)均分為2個(gè)亞組，其中的一個(gè)亞組用于Western blot檢測(cè)CHOP、caspase-12和caspase-3的蛋白表達(dá)水平；另一個(gè)亞組用于免疫熒光檢測(cè)caspase-12、CHOP表達(dá)陽性細(xì)胞比率，TUNEL法測(cè)脊髓細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.2 主要儀器與試劑全自動(dòng)酶標(biāo)儀（日本Corona），電泳儀（美國(guó)Bio-Rad），ECL顯像儀（美國(guó)Aplegen），熒光顯微鏡（日本Olympus）。小鼠抗大鼠CHOP抗體（cell signaling technolo?gy）；兔抗大鼠caspase-12，兔抗大鼠Cleaved caspase-3（英國(guó)abcam）；驢抗小鼠熒光二抗，驢抗兔熒光二抗（美國(guó)Abb?kine），小鼠抗大鼠β-actin，山羊抗兔IgG二抗及山羊抗小鼠IgG二抗（Santa Cruz Biotechnology）；依達(dá)拉奉（大連美侖生物科技有限公司）；增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Mil?lipore）；TUNEL試劑盒（美國(guó)Roche）。

1.3 動(dòng)物處理及模型的構(gòu)建SD大鼠用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，取俯臥位，75%乙醇常規(guī)消毒，在T8～T10處正中縱行切開皮膚，暴露T8～T10椎板和硬脊膜區(qū)域2 cm×2 cm，咬骨鉗咬除棘突和椎板暴露脊髓。以10 g× 5 cm的沖量采用Allen打擊法建立T9脊髓中度損傷模型。打擊瞬間可見大鼠雙后肢抽搐，尾痙攣擺動(dòng)，即為SCI造模成功。sham組僅顯露T8～T10節(jié)段脊髓，不予以打擊。術(shù)后sham組和SCI組給予與EDA組等體積等頻次的生理鹽水處理；EDA組在SCI模型建成后予以EDA（10 mg/kg），每12 h腹腔注射給藥1次。所有的鼠術(shù)后給予腹腔注射4萬U/d青霉素抗感染，在室溫20～25℃，濕度40%～60%的環(huán)境中喂養(yǎng)，每天人工按壓膀胱排尿2～3次。

1.4 CHOP、Cleaved caspase-12和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè)打擊3 d后，將3組中各一個(gè)亞組的動(dòng)物采用10%水合氯醛麻醉，并在冰塊上快速取出脊髓，以脊髓打擊點(diǎn)為中心取長(zhǎng)約1 cm（100 mg）的脊髓。按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書的步驟測(cè)定各樣品的蛋白濃度。上樣總蛋白量為40 μg，室溫下SDS-PAGE凝膠電泳，并將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，常規(guī)封閉，洗膜后加相應(yīng)蛋白濃度的一抗于4℃恒溫箱中孵育過夜，洗膜后與相應(yīng)的二抗于室溫孵育1.5 h，隨后ECL顯色儀獲取照片。用Image J 2x軟件求出各蛋白與β-actin灰度值，并求出比值反映各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 免疫熒光檢測(cè)CHOP和caspase-12陽性細(xì)胞比率打擊后3 d，將3組中各另一個(gè)亞組予以麻醉，行心臟灌注。先用生理鹽水灌注150 mL左右，后采用4%多聚甲醛灌注約30 min，灌注成功時(shí)，小腿抽動(dòng)。灌注結(jié)束后，迅速完整地取出距打擊中心上下各3 mm，長(zhǎng)約6 mm的脊髓組織并將其置于4%多聚甲醛中固定24 h，再置于30%蔗糖溶液中浸泡脫水24 h，在-20℃冰凍切片機(jī)中用OCT包埋，并分別在距離損傷中心點(diǎn)頭側(cè)和尾側(cè)各2 mm處連續(xù)橫斷面切片，厚度5 μm。將切片用1×PBS洗3次，每次5 min，置于封閉液中封閉120 min，吸出封閉液，加入稀釋的一抗，4℃孵育過夜后上熒光素標(biāo)記的二抗，在室溫避光條件下孵育1.5 h，然后用1× PBS洗3次，每次5 min，加DAPI，封片，于熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞核中出現(xiàn)綠色顆粒為CHOP陽性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)紅色顆粒為caspase-12陽性細(xì)胞。每個(gè)組織切片均隨機(jī)讀取6個(gè)不重疊的高倍（×400）視野，計(jì)數(shù)6個(gè)視野的cas?pase-12或CHOP陽性細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，以陽性細(xì)胞總數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值反映每片組織中蛋白的表達(dá)情況。

1.6 TUNEL法檢測(cè)脊髓細(xì)胞凋亡指數(shù)各組脊髓組織的灌注固定、取材、制片過程同上。按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，細(xì)胞核中出現(xiàn)紅色顆粒為陽性。用熒光顯微鏡在每片組織片上隨機(jī)讀取6個(gè)不重疊的高倍（× 200）視野進(jìn)行觀察。凋亡指數(shù)（AI）定義為100個(gè)細(xì)胞核中凋亡細(xì)胞核的平均個(gè)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)結(jié)果sham組Cleaved cas?pase-12、CHOP和Cleaved caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于SCI組和EDA組，EDA組較SCI組3種蛋白相對(duì)表達(dá)量亦下調(diào)（P＜0.01），見表1，圖1。

Tab.1 The relative expression levels of cleaved caspase-12，CHOP and Cleaved caspase-3 protein in three groups表1 Cleaved caspase-12、CHOP和Cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量（n=6）

Tab.1 The relative expression levels of cleaved caspase-12，CHOP and Cleaved caspase-3 protein in three groups表1 Cleaved caspase-12、CHOP和Cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量（n=6）

＊＊P＜0.01；a與sham組比較，b與SCI組比較，P＜0.05；表2同

組別sham組SCI組EDA組F Cleaved caspase-12 0.051±0.025 0.821±0.094a0.616±0.086ab170.315＊＊CHOP 0.149±0.016 1.321±0.219a0.744±0.131ab82.765＊＊Cleaved caspase-3 0.053±0.015 0.394±0.049a0.254±0.025ab160.622＊＊

Fig.1 Western blot analysis of Cleaved caspase-12，CHOP and Cleaved caspase-3 in three groups圖1 Western blot檢測(cè)各組Cleaved caspase-12、CHOP和Cleaved caspase-3的表達(dá)

2.2 免疫熒光檢測(cè)caspase-12、CHOP陽性細(xì)胞比率結(jié)果sham組脊髓組織中caspase-12、CHOP陽性細(xì)胞比率低于SCI和EDA組，EDA組較SCI組降低（P＜0.01），見圖2、表2。

Tab.2 The positive expression rates and apoptotic index of caspase-12，CHOP and TUNEL表2 Caspase-12，CHOP和TUNEL陽性細(xì)胞比率及凋亡指數(shù)（n=6）

組別sham組SCI組EDA組F caspase-12陽性細(xì)胞比率0.020±0.015 0.193±0.026a0.143±0.027ab79.631＊＊CHOP陽性細(xì)胞比率0.098±0.031 0.419±0.051a0.246±0.037ab94.815＊＊AI（%）1.85±1.15 15.44±2.04a10.63±2.15ab84.238＊＊

2.3 TUNEL檢測(cè)結(jié)果sham組中未見明顯細(xì)胞凋亡；SCI組中AI高于sham和EDA組（P＜0.01），見圖3、表2。

3 討論

SCI是脊柱外科的一種常見的神經(jīng)損傷性疾病，近年來其發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)，且具有高致殘率特點(diǎn)。在細(xì)胞中鈣離子的失衡和氧化應(yīng)激可激活ERS凋亡通路，引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而加重SCI［6］。因此，研究如何阻斷SCI后的ERS可能對(duì)SCI的治療具有意義。

ERS引起的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中，caspase-12和CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞凋亡途徑的2個(gè)標(biāo)志性蛋白［7］。Caspase-12是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種半胱天冬酶，ERS時(shí)caspase-12表達(dá)增加并活化，可直接激活與細(xì)胞凋亡相關(guān)的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而引起細(xì)胞凋亡［8］。另外，ERS時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK發(fā)生聚集并活化以激活轉(zhuǎn)錄因子elF2α，促進(jìn)活化的轉(zhuǎn)錄因子ATF4的表達(dá)增加，從而使核轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)增加［9］。CHOP可通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)凋亡的作用［10］。本研究通過West?ern blot和免疫熒光技術(shù)分別從蛋白水平和組織水平檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑的標(biāo)志蛋白caspase-12和CHOP的表達(dá)，結(jié)果顯示，SCI 3 d后，SCI組大鼠脊髓組織中活化的caspase-12和CHOP的表達(dá)量較sham組增高，表明脊髓細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑已被激活，與Zhang等［11］研究相似。Western blot檢測(cè)顯示，SCI 3 d后，SCI組較sham組Cleaved cas?pase-3的表達(dá)量顯著增加。并且TUNEL染色結(jié)果顯示，SCI組較sham組脊髓細(xì)胞AI亦增加，表明SCI 3 d后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞凋亡途徑已經(jīng)激活，并可能導(dǎo)致caspase-3調(diào)控的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

EDA是一種強(qiáng)效的氧自由基清除劑和抗氧化劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床腦卒中的治療。研究發(fā)現(xiàn)，EDA可通過抑制氧自由基介導(dǎo)的氧化性損傷，從而減輕缺血再灌注對(duì)脊髓的損傷［12］，并且可促進(jìn)SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)［13］。最近，一項(xiàng)應(yīng)用EDA對(duì)比甲基潑尼松龍（MP）治療SCI 8 h后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，EDA組caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)較MP組更少，Bcl-xl的表達(dá)量較MP組的表達(dá)更高，EDA對(duì)SCI的維持治療似乎更有效［14］。但是，關(guān)于EDA治療SCI的分子生物學(xué)機(jī)制仍不十分清楚。本研究顯示，SCI 3 d后EDA組Cleaved caspase-12、CHOP和Cleaved caspase-3的表達(dá)和脊髓細(xì)胞AI較SCI組均降低，表明EDA對(duì)SCI具有保護(hù)作用，機(jī)制可能與其可顯著抑制SCI后ERS，并可抑制caspase-3調(diào)控的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮脊髓保護(hù)作用相關(guān)。

綜上所述，依達(dá)拉奉對(duì)SCI的保護(hù)作用可能與其可抑制SCI后的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑并抑制脊髓細(xì)胞凋亡有關(guān)，有可能成為SCI治療的一線用藥。但是，臨床上MP治療SCI具有最佳的時(shí)間窗，而EDA應(yīng)用于SCI治療是否存在時(shí)間窗的問題仍有待進(jìn)一步的研究。

（圖2、3見插頁）

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（2015-01-29收稿2015-04-30修回）

（本文編輯陸榮展）

Preliminary mechanism of edaravone against cell apoptosis after spinal cord injury in rats

WANG Jiquan，ZHAO Xingchang，SUN Ping，LI Haotian，CHU Xin，LYU Gang，F(xiàn)AN Zhongkai△
First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China△

ObjectiveTo investigate the effects of edaravone（EDA）on cell apoptosis induced by endoplasmic reticu?lum stress（ESR）after spinal cord injury（SCI）in rats.MethodsThirty-six healthy adult SD rats were randomly divided in?to three groups（12 rats for each group）：Sham group，SCI group and EDA group.The rat model of SCI was made by Allen's method and the sham group was only received laminectomy and kept the spinal cord intact.Rats in sham group and SCI group accepted the same volume and frequency of saline injection as EDA group.The EDA group was given 10 mg/kg EDA once every 12 h intraperitoneally.Three days after injuring，the spinal cords were harvested，and the protein levels of C/EBP homologous protein（CHOP），Cleaved caspase-12 and Cleaved caspase-3 were detected by Western blot assay.Immunofluo?rescence staining was used to analyze the positive ratio of caspase-12 and CHOP in spinal cord of three groups.Meanwhile，TUNEL staining was used to identify cell apoptosis of spinal cord.ResultsCompared with sham group，the protein levels of CHOP，Cleaved caspase-12 and Cleaved caspase-3 were obviously higher in SCI group（P＜0.01）；the proportion of Cas?pase-12 and CHOP positive cells was significantly increased（P＜0.01），and the apoptotic rates were also significantly in?creased in spinal cord（P＜0.01）.However，compared with SCI group，the protein levels of CHOP，Cleaved caspase-12 and Cleaved caspase-3 were significantly decreased in EDA group（P＜0.01）；the proportion of Caspase-12 and CHOP positive cells was significantly reduced（P＜0.01），and the apoptotic rates were also significantly decreased in spinal cord（P＜0.01）. ConclusionEDA has neuroprotective potential to spinal cord injury.The mechanism of its neuroprotective effect may asso?ciate with its inhibitory effect to the cell apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress after SCI.

spinal cord injury；apoptosis；caspase 3；caspase 12；models，animal；rats，Sprague-Dawley；endoplasmic reticulum stress；edaravone；transcription factor CHOP

R651.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.008

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272074）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（LJQ2014091）；遼寧醫(yī)學(xué)院校長(zhǎng)基金項(xiàng)目（QM2014011）

遼寧錦州，遼寧省遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科（郵編121001）

王繼權(quán)（1989），男，碩士在讀，主要從事脊髓損傷的機(jī)制及修復(fù)研究

△通訊作者E-mail：flanzz@163.com