王欣，秦宇

白細(xì)胞介素-1β對大鼠軟骨細(xì)胞MMP-13表達(dá)的影響及miR-27b的調(diào)控作用

王欣1，2，秦宇1

目的觀察白細(xì)胞介素（IL）-1β對大鼠軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13表達(dá)的影響及miR-27b的調(diào)控作用。方法雄性Wistar大鼠7只提取軟骨細(xì)胞。Western blot檢測IL-1β刺激軟骨細(xì)胞0 h、24 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)MMP-13表達(dá)變化；miRNAs微陣列分析48 h內(nèi)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)的miRNAs；Real-time PCR定量分析篩選出下調(diào)最為明顯的miRNAs；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-27b與MMP-13的靶定調(diào)控關(guān)系。結(jié)果IL-1β刺激軟骨細(xì)胞后，MMP-13蛋白在0 h、24 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)逐漸增加（P＜0.05）；miRNAs微陣列分析發(fā)現(xiàn)48 h內(nèi)軟骨細(xì)胞有36個(gè)miRNAs出現(xiàn)表達(dá)變化，變化最為明顯的有6個(gè)，分別為miR-27b、miR-31、miR-26a、miR-26b、miR-23、miR-204；Real-time PCR顯示miR-27b下調(diào)最為明顯；miR-27b擬似物和熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后，熒光素酶活性受到明顯抑制（P＜0.05）。結(jié)論IL-1β刺激軟骨細(xì)胞后，出現(xiàn)miR-27b的表達(dá)下調(diào)和MMP-13蛋白的表達(dá)上調(diào)，miR-27b與MMP-13存在靶定調(diào)控關(guān)系。

軟骨細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶13；微RNAs；白細(xì)胞介素1β；微陣列分析；微小RNA-27b

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為負(fù)重關(guān)節(jié)軟骨局限性、進(jìn)行性破壞及關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成，并伴有不同程度的滑膜炎癥。臨床上可產(chǎn)生關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等癥狀。OA的發(fā)病可能與細(xì)胞因子、自由基、肥胖、雌激素缺乏等因素有關(guān)，但確切病因尚未完全闡明［1-2］。軟骨細(xì)胞位于細(xì)胞外基質(zhì)中，后者是軟骨的主要功能載體，由Ⅱ型膠原蛋白和軟骨中特有的蛋白多糖構(gòu)成［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）被認(rèn)為在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的破壞和重建中發(fā)揮重要作用，其中MMP-13具有廣泛的酶活性，對Ⅱ型膠原具有最為活躍的降解能力［4］。白細(xì)胞介素（IL）-1β是一種有效的MMP誘導(dǎo)劑，在軟骨的降解、退變過程中起重要作用［5］。目前關(guān)于IL-1β對MMP-13的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。近年發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNAs，miRNAs）通過與靶基因3′端非編碼區(qū)（3′Untranslated Region，3′UTR）結(jié)合，在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制靶mRNA表達(dá)或誘導(dǎo)mRNA降解，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的關(guān)鍵因素［6］。有證據(jù)表明，miRNAs表達(dá)改變參與了OA過程中軟骨細(xì)胞損傷［7］。本研究擬以大鼠軟骨細(xì)胞為研究對象，探討IL-1β的刺激下，miRNAs差異表達(dá)與MMP-13之間的關(guān)系，為OA早期防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取體質(zhì)量180～220 g的雄性Wistar大鼠（SPF級，由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。實(shí)驗(yàn)室溫度20～25℃，濕度50%～60%，自由飲水。

1.1.2 儀器與試劑倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Ther?mo Scientific CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）；凝膠成像儀（美國SynGene公司）；電子天平（上海精密儀器科技有限公司）；臺式離心機(jī)（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司）；DMEM胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；Lipofectamine 2000、NCode?VILO?miRNA cDNA合成試劑盒（美國Invitrogen公司）；mirvana?miRNA分離試劑盒、TaqMan MicroRNA Array v2.0（美國Applied Biosystems公司）；MMP-13兔抗大鼠單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；miR-27b擬似物、miR-27b拮抗劑、陰性對照（上海吉瑪制藥技術(shù)公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)（美國Promega公司）

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及分組參考文獻(xiàn)［8］，將雄性Wistar大鼠7只，以10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，超凈平臺中無菌條件下切去髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)軟骨，切成1～2 mm3碎塊，以0.25%胰蛋白酶消化，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶10 mL，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化4～5 h，濾去軟骨組織，濾液以3 000 r/min離心5 min，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁融合率達(dá)85%～90%時(shí)，即用胰蛋白酶消化并進(jìn)行傳代，第3代軟骨細(xì)胞按1×106/孔接種于6孔板。每3孔作為一組，分為對照組和IL-1β刺激組。對照組不予刺激。IL-1β刺激組用含有10 μg/L無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞，于第24 h和48 h以倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，同時(shí)收集細(xì)胞并提取RNA。

1.2.2 細(xì)胞核形的觀察培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞置于玻片上，以PBS洗滌3遍，后滴加幾滴DAPI（4′，6-diamidino-2-phenyl?indole）染液，染色10 min。流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加1滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長360～400 nm。

1.2.3 miRNA微陣列分析軟骨細(xì)胞總RNA以mirvana?miRNA分離試劑盒提取，分離方法參照說明書進(jìn)行。總RNA的濃度和純度用分光光度計(jì)評估。提取5 μg RNA進(jìn)行微陣列分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依照NCode? VILO?miRNA cDNA合成試劑盒的方法合成cDNA，根據(jù)GenBank的基因序列為miR-27b、miR-31、miR-26a、miR-26b、miR-23、miR-204設(shè)計(jì)引物，取U6作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸40 min。結(jié)果用Applied Biosystems SDS軟件包（2.2版）分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因首先應(yīng)用生物信息學(xué)軟件Targetscan（http：//www.targetscan.org）和PicTar（http：//pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/new_PicTar_vertebrate.cgi？species=vertebrate）分析miR-27b可能的靶基因。再以基因組DNA為模板擴(kuò)增MMP-13的3′-UTR，在引物中引入PmeⅠ和XbaⅠ的酶切點(diǎn)和保護(hù)堿基。引物序列為：上游5′-GA?CAGCAUAGGCGAUAAGAGCGCCGAAAG-3′；下游5′-GCG?GAAGACCCGACGGACCCGGAGGCCCG-3′，測序正確后克隆到pmirGLO熒光素酶質(zhì)粒，獲得pGLO-MMP13-3′-UTR重組質(zhì)粒。體外合成含上述位點(diǎn)突變體的DNA片段，測序正確后克隆到pmirGLO熒光素酶質(zhì)粒，突變質(zhì)粒命名為pG?LO-MMP13-3′-UTR-mut。將細(xì)胞接種于24孔板中，按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染pGLOMMP13-3′-UTR序列、pGLO-MMP13-3′-UTR-mut序列、miR-27b擬似物序列、miR-27b拮抗劑序列和對照序列。培養(yǎng)24 h后，用熒光素酶檢測試劑盒測定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值代表細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染效率通過Real-time PCR和Western blot法檢測。

1.2.6 Western blot檢測MMP-13蛋白的表達(dá)放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（RIPA）裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清液提取總蛋白。每條泳道以40 μg蛋白量上樣，7.5%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，濕法轉(zhuǎn)移將蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入制定的MMP-13一抗，4℃過夜，洗膜，后用HRP標(biāo)記的二抗常規(guī)孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑反應(yīng)1 min，曝光成像。以β-actin作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及細(xì)胞核的改變接種后，光學(xué)顯微鏡下可見懸浮于培養(yǎng)液中的軟骨細(xì)胞為小圓形，靜置24 h后，大多數(shù)細(xì)胞開始貼壁、增殖，并逐漸融合形成單層，呈不規(guī)則立體“鋪路石”樣。DAPI染色后見細(xì)胞核熒光著色均勻，胞核結(jié)構(gòu)正常。IL-1β處理24 h后，部分細(xì)胞由圓形或橢圓形逐漸變成長梭形，細(xì)胞膜完整性被破壞。DAPI染色后，部分胞核因染色質(zhì)聚集而呈現(xiàn)出核區(qū)致密濃染，核區(qū)熒光發(fā)白發(fā)亮。IL-1β處理48 h后，上述形態(tài)變化更加明顯，見圖1。

Fig.1Observation of chondrocyte morphology induced by IL-1β（×400）圖1 IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×400）

2.2 IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞MMP-13表達(dá)變化IL-1β處理軟骨細(xì)胞48 h內(nèi)MMP-13表達(dá)逐漸增加（F=20.453，P＜0.05）。其中，24 h時(shí)MMP-13蛋白表達(dá)較0 h明顯增加（0.47±0.04 vs 0.21±0.02，P＜0.05），處理48 h后MMP-13蛋白表達(dá)（0.77±0.06）較24 h增加更為明顯（P＜0.05），見圖2。

Fig.2Changes in MMP-13 expression in rat chondrocytes upon IL-1β stimulation圖2 IL-1β處理后軟骨細(xì)胞MMP-13蛋白表達(dá)變化

Fig.3miRNA microarray of rat chondrocytes 48 h after IL-1β stimulation圖3 IL-1β處理軟骨細(xì)胞48 h后miRNAs微陣列芯片的差異表達(dá)分析

Tab.1Expression of 6 most obviously changed miRNAs in rat chondrocytes upon IL-1β stimulation for 48 h表1 IL-1β處理軟骨細(xì)胞48 h，改變最為明顯的6個(gè)miRNAs表達(dá)情況（n=3，）

Tab.1Expression of 6 most obviously changed miRNAs in rat chondrocytes upon IL-1β stimulation for 48 h表1 IL-1β處理軟骨細(xì)胞48 h，改變最為明顯的6個(gè)miRNAs表達(dá)情況（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與0 h比較，b與24 h比較，P＜0.05

時(shí)間0 h 2 4 h 4 8 h F m i R -2 7 b 1 ± 0 0 . 4 7 7 ± 0 . 2 6 3 a 0 . 1 6 7 ± 0 . 0 1 5 a b 2 3 . 0 5 1＊＊m i R -3 1 1 ± 0 0 . 6 8 3 ± 0 . 0 6 1 a 0 . 3 4 7 ± 0 . 1 9 7 a b 2 2 . 5 1 6＊＊m i R -2 6 a 1 ± 0 1 . 5 5 7 ± 0 . 2 0 5 a 2 . 6 1 3 ± 0 . 2 9 3 a b 4 7 . 3 0 4＊＊時(shí)間0 h 2 4 h 4 8 h F m i R -2 0 4 1 ± 0 2 . 7 7 7 ± 0 . 2 7 2 a 3 . 6 1 3 ± 0 . 4 9 9 a b 4 9 . 6 0 0＊＊m i R -2 6 b 1 ± 0 1 . 6 4 0 ± 0 . 2 2 3 a 2 . 6 6 3 ± 0 . 2 8 4 a b 4 8 . 6 0 8＊＊m i R -2 3 1 ± 0 2 . 6 0 7 ± 0 . 4 0 1 a 3 . 4 7 0 ± 0 . 4 3 9 a b 4 0 . 0 6 8＊＊

2.3 IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞miRNAs差異表達(dá)變化及結(jié)果驗(yàn)證miRNA微陣列分析顯示，IL-1β處理軟骨細(xì)胞的24 h及48 h后，有36個(gè)miRNAs表達(dá)水平發(fā)生改變。在表達(dá)減少的miRNAs中，miR-27b、miR-31下調(diào)最為明顯；表達(dá)增加的miRNAs中，miR-26a、miR-26b、miR-23、miR-204上調(diào)最為明顯，見圖3。與miRNAs微陣列分析結(jié)果一致，miR-27b和miR-31在IL-1β處理24 h及48 h表達(dá)逐漸下調(diào)。miR-26a、miR-26b、miR-23、miR-204在24 h及48 h表達(dá)逐漸上調(diào)，見表1。miRNAs微陣列分析及Realtime PCR均表明，IL-1β處理軟骨細(xì)胞48 h后，miR-27b下調(diào)最為明顯。

2.4 miR-27b靶定調(diào)控MMP-13Targetscan和Pic? Tar分析發(fā)現(xiàn)，miR-27b在基因MMP-13 3′-UTR預(yù)測到作用靶點(diǎn)，見圖4a。軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-27b擬似物后MMP-13蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖4b。miR-27b擬似物和熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后，熒光素酶活性受到明顯抑制；miR-27b擬似物與pGLO-MMP13-3′-UTR-mut共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性較對照組無明顯變化，見圖4c。軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-27b拮抗劑抑制內(nèi)源性miR-27b表達(dá)后，熒光素酶活性與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4d。

Fig.4miR-27b and MMP-13 present targeted regulation relationship圖4 miR-27b靶定調(diào)控MMP-13

3 討論

3.1 miR-27b對OA發(fā)展的調(diào)控作用本研究顯示，正常軟骨細(xì)胞不表達(dá)或表達(dá)極微量的MMP-13蛋白，IL-1β處理軟骨細(xì)胞48 h過程中，MMP-13蛋白表達(dá)逐漸增加，miR-27b表達(dá)明顯下降，經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-27b可以靶定調(diào)控軟骨細(xì)胞MMP13表達(dá)，說明miR-27b可能在OA發(fā)展過程中起到調(diào)控樞紐作用。

3.2 IL-1β、MMP-13與OA過程中軟骨破壞密切相關(guān)MMPs是一大類具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白酶，構(gòu)成了細(xì)胞外基質(zhì)降解最重要的蛋白水解系統(tǒng)，在組織重建和修復(fù)中起重要作用。MMP-13是與OA密切相關(guān)的一種膠原酶，主要分解關(guān)節(jié)原有的Ⅱ型膠原，后者是膠原的主要組成部分，占膠原總量的80%～95%，在關(guān)節(jié)承受力方面必不可少［9］。Ⅱ型膠原的不斷分解可造成軟骨慢性進(jìn)行性破壞，給關(guān)節(jié)帶來不可逆損傷。有研究表明，IL-1β是一種有效的MMP誘導(dǎo)劑，有促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝和降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，用抗體中和IL-1β后可以阻止軟骨和骨的破壞［10］。IL-1β在OA患者關(guān)節(jié)液中大量存在，被認(rèn)為是OA中起關(guān)鍵作用的促炎癥性細(xì)胞因子［11］。MMP過表達(dá)或長時(shí)間表達(dá)將導(dǎo)致OA的發(fā)生，產(chǎn)生MMP的細(xì)胞必須采用多重機(jī)制保持對MMP的調(diào)控［12］。本研究表明，IL-1β刺激大鼠軟骨細(xì)胞后MMP-13蛋白表達(dá)明顯增加且呈時(shí)間依賴性，IL-1β可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制參與了MMP-13蛋白的上調(diào)。

3.3 miR-27b靶定調(diào)控MMP-13miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，通過調(diào)控靶基因表達(dá)影響細(xì)胞生物學(xué)行為。單個(gè)miRNA分子可以調(diào)控?cái)?shù)十到數(shù)百個(gè)基因，內(nèi)源性miRNA雖然只占人類基因總數(shù)的2%，卻調(diào)控著人類全基因組中30%以上的基因，其作為基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯過程中的調(diào)節(jié)分子［13］，miRNAs的差異表達(dá)可能與OA有關(guān)［14］。本研究表明，IL-1β處理軟骨細(xì)胞的24 h及48 h后，miR-27b下調(diào)最為明顯。生物信息學(xué)分析表明，miR-27b在MMP-13 mRNA 3′-UTR存在潛在作用的靶點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MMP-13為miR-27b作用的靶基因。大鼠19號染色體存在2個(gè)miR-27基因（Mir27a和Mir27b），成熟的miR-27a和miR-27b在3′-UTR只有1個(gè)不同的核苷酸序列。而本研究中大鼠軟骨細(xì)胞miR-27a的差異表達(dá)并未被檢測到，由此可以認(rèn)為與miR-27a不同，miR-27b為IL-1β的應(yīng)答基因。在IL-1β的刺激下，軟骨細(xì)胞miR-27b表達(dá)明顯減少，不能有效靶定下調(diào)MMP-13蛋白的表達(dá)，從而造成軟骨細(xì)胞MMP-13的明顯上調(diào)。

3.4 核因子（NF）-κB可能參與了miR-27b對MMP-13的調(diào)控NF-κB屬于核轉(zhuǎn)錄因子成員，能與多種基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。目前的研究顯示NF-κB參與對miRNA的表達(dá)調(diào)控［15］。IL-1β介導(dǎo)的MMP-13蛋白表達(dá)需要NF-κB的激活［16］，且軟骨細(xì)胞中NF-κB激活對miR-27b的表達(dá)起負(fù)性調(diào)控作用［17］。本研究顯示，IL-1β處理軟骨細(xì)胞后miR-27b表達(dá)明顯減少，伴隨MMP-13蛋白表達(dá)增加，可能與NF-κB的激活有關(guān)。

綜上所述，IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞miR-27b表達(dá)明顯下調(diào)，對MMP-13靶定調(diào)控作用減弱，造成軟骨細(xì)胞損傷，此過程可能參與了OA的發(fā)生、發(fā)展。本研究從miRNAs的角度為軟骨細(xì)胞損傷機(jī)制提供了證據(jù)，為OA防治提供了新的靶點(diǎn)。

［1］Malemud CJ，Islam N，Haqqi TM.Pathophysiological mechanisms in osteoarthritis lead to novel therapeutic strategies［J］.Cells Tissues Organs，2003，174（1-2）：34-48.doi：10.1159/000070573.

［2］Chen WG，Yang ZH，Liu QG，et al.Correlation between the severity of osteoarthritis and the serum levels of IL-4 and sIL-4R［J］.Med J Chin PLA，2015，40（1）：63-65.［陳文革，楊朝暉，劉清高，等.骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度與血清IL-4和sIL-4R水平的相關(guān)性研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2015，40（1）：63-65］.doi：10.11855/j.issn.0577-7402.2015.01.14.

［3］Wang X，Zhu Y，Tao H，et al.Interaction of ERK1/2 and Smad2/3 signaling pathways in TGF-β1-induced TIMP-3 expression in rat chondrocytes［J］.Arch Biochem Biophys，2014，564：229-236.doi：10.1016/j.abb.2014.09.009.

［4］Chen C，Ma C，Zhang Y，et al.Pioglitazone inhibits advanced glyca?tion end product-induced TNF-α and MMP-13 expression via the antagonism of NF-κB activation in chondrocytes［J］.Pharmacology，2014，94（5-6）：265-272.doi：10.1159/000369074.

［5］Sieghart D，Liszt M，Wanivenhaus A，et al.Hydrogen sulphide de?creases IL-1β-induced activation of fibroblast-like synoviocytes from patients with osteoarthritis［J］.J Cell Mol Med，2015，19（1）：187-197.doi：10.1111/jcmm.12405.

［6］Farh KK，Grimson A，Jan C，et al.The widespread impact of mam?malian MicroRNAs on mRNA repression and evolution［J］.Science，2005，310（5755）：1817-1821.doi：10.1126/science.1121158.

［7］Miyaki S，Sato T，Inoue A，et al.MicroRNA-140 plays dual roles in both cartilage development and homeostasis［J］.Genes Dev，2010，24（11）：1173-1185.doi：10.1101/gad.1915510.

［8］Ando K，Imai S，Isoya E，et al.Effect of dynamic compressive loading and its combination with a growth factor on the chondrocytic phenotype of 3-dimensional scaffold-embedded chondrocytes［J］.Acta Orthop，2009，80（6）：724-733.doi：10.3109/17453670903413111.

［9］Jansen ID，Hollander AP，Buttle DJ，et al.Type II and VI collagen in nasal and articular cartilage and the effect of IL-1alpha on the distribution of these collagens［J］.J Mol Histol，2010，41（1）：9-17. doi：10.1007/s10735-010-9257-7.

［10］Joosten LA，Helsen MM，Saxne T，et al.IL-1 alpha beta blockade prevents cartilage and bone destruction in murine type II collageninduced arthritis，whereas TNF-alpha blockade only ameliorates joint inflammation［J］.J Immunol，1999，163（9）：5049-5055.

［11］Hussein MR，F(xiàn)athi NA，El-Din AM，et al.Alterations of the CD4（+），CD8（+）T cell subsets，interleukins-1beta，IL-10，IL-17，tu?mor necrosis factor-alpha and soluble intercellular adhesion mole?cule-1 in rheumatoid arthritis and osteoarthritis：preliminary obser?vations［J］.Pathol Oncol Res，2008，14（3）：321-328.doi：10.1007/ s12253-008-9016-1.

［12］Wang P，Guan PP，Guo C，et al.Fluid shear stress-induced osteoar?thritis：roles of cyclooxygenase-2 and its metabolic products in in?ducing the expression of proinflammatory cytokines and matrix me?talloproteinases［J］.FASEB J，2013，27（12）：4664-4677.doi：10.1096/ fj.13-234542.

［13］Zheng RL，Jiang YJ，Wang X.Role of microRNAs on therapy resis?tance in Non-Hodgkin′s lymphoma［J］.Int J Clin Exp Med，2014，7（11）：3818-3832.

［14］Jones SW，Watkins G，Le Good N，et al.The identification of differ?entially expressed microRNAs in osteoarthritic tissue that modulate the production of TNF-α/MMP-13［J］.Ostearthritis Cartilage，2009，17（4）：464-472.doi：10.1016/j.joca.2008.09.012.

［15］Zhang X，Liu S，Hu T，et al.Up-regulated microRNA-143 tran?scribed by nuclear factor kappa B enhances hepatocarcinoma metas?tasis by repressing fibronectin expression［J］.Hepatology，2009，50（2）：490-499.doi：10.1002/hep.23008.

［16］Mengshol JA，Vincenti MP，Coon CI，et al.Interleukin-1 induction of collagenase 3（matrix metalloproteinase 13）gene expression in chondrocytes requires p38，c-Jun N-terminal kinase，and nuclear factor kappaB：differential regulation of collagenase 1 and collage?nase 3［J］.Arthritis Rheum，2000，43（4）：801-811.doi：10.1002/ 1529-0131（200004）43：4＜801.

［17］Akhtar N，Rasheed Z，Ramamurthy S，et al.MicroRNA-27b regu?lates the expression of matrix metalloproteinase 13 in human osteo?arthritis chondrocytes［J］.Arthritis Rheum，2010，62（5）：1361-1371.doi：10.1002/art.27329.

（2015-01-08收稿2015-03-06修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of interleukin-1β on MMP-13 expression in rat chondrocytes and its regulation of miR-27b

WANG Xin1，2，QIN Yu1
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Orthopedics，Tianjin Harbor Hospital

ObjectiveTo observe the effect of interleukin-1β（IL-1β）on expression of Matrix Metalloproteinases 13（MMP-13）in rat chondrocytes and its regulation of miR-27b.MethodsChondrocytes were extracted from 7 Wistar male rats.Expression of MMP-13 were examined by Western blot at 0 h，24 h，48 h after IL-1β stimulation.Differential miRNAs expression profiles were examined by miRNAs microarray.The most obviously down-regulated miRNAs were confirmed by quantitative Real-time PCR.Targeted regulation relationship between miR-27b and MMP-13 was set up by Luciferase re?porter gene experiments.ResultsExpression of MMP-13 in rat chondrocytes was increased at a timely dependent manner upon IL-1β stimulation（P＜0.05）；Microarray revealed 36 miRNAs whose expression changed，among which 6（miR-27b，miR-31，miR-26a，miR-26b，miR-23，miR-204）were especially obvious.Real-time PCR confirmed that miR-27b was the one whose expression level were most down-regulated.Transient co-transfection of miR-27b mimics with luciferase expres?sion plasmids resulted in significant repression of luciferase activity in rat chondrocytes（P＜0.05）.ConclusionIL-1β stimulation result in down-regulation of miR-27b and up-regulation of MMP-13 expression.MiR-27b and MMP-13 show targeted regulation relationship.

chondrocytes；matrix metalloproteinase 13；microRNAs；interleukin-1beta；microarray analysis；miR-27b

R349.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.011

1天津醫(yī)科大學(xué)（郵編300070）；2天津港口醫(yī)院骨科

王欣（1979），男，大學(xué)本科，主治醫(yī)師，主要從事骨科創(chuàng)傷研究