李曉+陳夢(mèng)云+王磊+張倩倩+方芳+苗麗+陸峰

摘 要 建立了弱主藥信號(hào)藥品中主藥成分的紙基-表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）快速檢測(cè)方法。采用浸泡法制備納米銀溶膠濾紙SERS基底（簡(jiǎn)稱銀膠紙），將待檢樣品滴加于銀膠紙上進(jìn)行SERS檢測(cè)。通過考察銀膠紙制備條件、銀膠紙?jiān)鰪?qiáng)能力、SERS檢測(cè)結(jié)果，建立用于弱主藥信號(hào)藥品中主藥成分的快速檢測(cè)方法。通過本方法獲得弱主藥信號(hào)藥品中主藥成分的SERS圖譜，與其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的相關(guān)系數(shù)大于0.9，較好地檢測(cè)出弱主藥信號(hào)藥品中的主藥成分，有效克服了常規(guī)拉曼光譜分析的不足之處。新型銀膠紙制備簡(jiǎn)單、增強(qiáng)效果明顯，與SERS法結(jié)合可簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)對(duì)弱主藥信號(hào)藥品中主藥信號(hào)的檢測(cè)，在弱主藥信號(hào)藥品快檢中具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 銀膠紙； 表面增強(qiáng)拉曼光譜； 弱主藥信號(hào)藥品； 相關(guān)系數(shù)

1 引 言

近年來(lái)，新藥研發(fā)的大方向是高效低毒，因此藥品中主藥成分（API）的含量總體趨勢(shì)是越來(lái)越低，即主藥含量通常遠(yuǎn)低于輔料，主藥基本被掩埋于輔料中。目前針對(duì)此類藥品的檢測(cè)基本上仍是停留在實(shí)驗(yàn)室分析中，如常用的高效液相色譜法[1]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[2]、光譜成像技術(shù)[3]等，但上述分析儀器龐大昂貴、操作復(fù)雜、專業(yè)技術(shù)要求高、分析耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)快檢分析的需求。然而，當(dāng)采用基于光譜法，如近紅外光譜法[4，5]、拉曼光譜法[6，7]等快檢分析時(shí)，主藥成分信息通常被部分或全部掩蓋于輔料的光譜信息中，呈現(xiàn)弱主藥信號(hào)現(xiàn)象，導(dǎo)致假陰性、假陽(yáng)性或無(wú)法判別的情況，從而給藥品監(jiān)督檢驗(yàn)帶來(lái)很大困難。

在常規(guī)拉曼光譜（NRS）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）能較好地彌補(bǔ)NRS的不足。SERS技術(shù)更可使NRS信號(hào)增強(qiáng)105倍以上，其基底[8]也是多種多樣，尤其是納米銀溶膠濾紙（以下簡(jiǎn)稱“銀膠紙”），因其制備簡(jiǎn)單、攜帶方便等優(yōu)勢(shì)，結(jié)合SERS技術(shù)在環(huán)境樣品分析[9]、中藥材染色篩查[10，11]等領(lǐng)域得到了應(yīng)用，但在弱主藥信號(hào)藥品研究中尚未見報(bào)道。

本研究以新型銀膠紙作為SERS基底，以幾種弱主藥信號(hào)藥品（阿司咪唑片、苯磺酸氨氯地平片、鹽酸特拉唑嗪片、鹽酸西替利嗪片）為研究對(duì)象，采用研磨、溶解、離心等操作提取主藥成分后， 進(jìn)行SERS檢測(cè)。此類藥品及其標(biāo)準(zhǔn)品NRS圖譜相關(guān)系數(shù)小于0.2，而SERS圖譜相關(guān)系數(shù)大于0.9，因此 SERS技術(shù)能較好地增強(qiáng)弱主藥信號(hào)藥品中的主藥成分信號(hào)，且方法操作簡(jiǎn)單、高效快捷、精密度好，為當(dāng)前盛行的小劑量、強(qiáng)藥效、弱主藥信號(hào)藥品快檢提供了有力支撐，從而較好地保障藥品的質(zhì)量安全。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

BWS415-785H型便攜式拉曼光譜儀（美國(guó)B&W Tek 公司），激發(fā)波長(zhǎng)785 nm，分辨率3 cm

1，光譜范圍175 ～ 2700 cm；ALPHA型傅立葉變換紅外光譜儀（Bruker 公司），光譜范圍00～4000 cm

，分辨率4 cm1；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG16-WS型高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；掃描電子顯微鏡（德國(guó)Zeiss EVO MA-10 Carl-Zeiss公司）。

阿司咪唑、苯磺酸氨氯地平、鹽酸特拉唑嗪、鹽酸西替利嗪、對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為100301-199901， 100374-201204， 100375-201103， 100660-201102， 100018-200408；實(shí)驗(yàn)所用藥品均購(gòu)自市售藥店。

AgNO3、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、甲醇等試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；定量濾紙（杭州沃華濾紙有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 溶液的配制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

分別準(zhǔn)確稱取阿司咪唑、苯磺酸氨氯地平、鹽酸特拉唑嗪、鹽酸西替利嗪標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇溶解，分別制成5 mg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。

2.2.2 樣品溶液 分別取阿司咪唑片（規(guī)格：3 mg）、苯磺酸氨氯地平片（5 mg）、鹽酸特拉唑嗪片（2 mg）、鹽酸西替利嗪片（10 mg）各1片，研碎，溶于1 mL甲醇中，超聲30 min，離心取上清液，作為樣品溶液備用。

2.3 銀膠紙的制備

將5 mL AgNO3-PVP（0.02 mol/L AgNO3、 9 mg PVP）混合溶液加入至50 mL 沸騰的DMF中，繼續(xù)加熱一段時(shí)間后，倒入棕色瓶中，冷卻備用。

將普通濾紙浸泡于上述銀溶膠中，避光放置 22 h后取出，吹干，將上述濾紙裁剪成1 cm×1 cm方形備用。

2.4 SERS檢測(cè)

取上述樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL，分別滴加于銀膠紙上，滴加區(qū)立即進(jìn)行檢測(cè)，激光功率為180 mW，積分時(shí)間為15 s，得到各自的SERS圖譜并進(jìn)行比對(duì)。

2.5 數(shù)據(jù)處理

利用Matlab2013a對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行譜段選?。?00～1800 cm1）、基線校正、平滑濾噪，矢量歸一化等預(yù)處理后，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算相關(guān)系數(shù)，如公式 （1） 所示。采用Origin 8.0 軟件對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行繪圖。

R=ni=1（Xi·Yi）ni=1X2i·ni=1Y2i（1）

式中，X和Y分別代表樣品與標(biāo)準(zhǔn)品光譜數(shù)據(jù)，i代表每條光譜的第i個(gè)變量，n為該條光譜變量總數(shù)。

圖1 對(duì)乙酰氨基酚片（a）與其標(biāo)準(zhǔn)品（b）的拉曼光譜

Fig.1 Raman spectra of paracetamol tablet （a） and its standard （b）endprint

3 結(jié)果與討論

3.1 弱主藥信號(hào)藥品篩選

3.1.1 弱主藥信號(hào)藥品與強(qiáng)主藥信號(hào)藥品對(duì)比

以對(duì)乙酰氨基酚片為例，檢測(cè)NRS，并與其標(biāo)準(zhǔn)品NRS進(jìn)行對(duì)比（如圖1），其相關(guān)系數(shù)為0.9978，表明樣品常規(guī)拉曼光譜中幾乎完全是主藥信號(hào)，輔料對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，故可作為強(qiáng)主藥信號(hào)藥品。

將阿司咪唑片、苯磺酸氨氯地平片、鹽酸特拉唑嗪片、鹽酸西替利嗪片及其標(biāo)準(zhǔn)品NRS光譜進(jìn)行對(duì)比（如圖2），得到相關(guān)系數(shù)分別為0.1711， 0.1562，

0.0534和0.129，均低于0.2，表明樣品NRS幾乎未檢測(cè)出主藥成分圖譜，輔料嚴(yán)重干擾檢測(cè)，由此可見，此類藥品的檢測(cè)難度遠(yuǎn)大于強(qiáng)主藥信號(hào)藥品。一般情況下，NRS無(wú)法達(dá)到對(duì)此類弱主藥信號(hào)藥品快速檢測(cè)的目的。

圖2 4種藥品（a）與其標(biāo)準(zhǔn)品（b）的拉曼光譜

Fig.2 Raman spectra of the four drugs （a） and their standards （b）

A： 阿司咪唑片； B： 苯磺酸氨氯地平片； C： 鹽酸特拉唑嗪片； D： 鹽酸西替利嗪片。

A： Astemizole tablet； B： Amlodipine besylate tablet； C： Terazosin hydrochloride tablet； D： Cetirizine hydrochloride tablet.

3.1.2 弱主藥信號(hào)藥品解析 經(jīng)過深度剖析，將上述4種藥品與輔料乳糖的NRS圖譜[12]對(duì)比（圖3A），相關(guān)系數(shù)分別為0.9483， 0.9512， 0.9626和0.9878，表明該類藥品拉曼光譜幾乎反映的是乳糖信號(hào)。由于NRS是散射光譜，部分物質(zhì)拉曼極化效應(yīng)弱，對(duì)物質(zhì)檢測(cè)有一定局限性，而通常紅外光譜與拉曼光譜能互相補(bǔ)充，互相佐證。因此，將上述4種藥品與乳糖的紅外圖譜對(duì)比（圖3B）發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)分別為0.9746， 0.9718， 0.9566和0.9595，該類藥品紅外光譜檢測(cè)出的同樣是輔料乳糖的信號(hào)，由此可進(jìn)一步說(shuō)明，弱主藥信號(hào)藥品存在主藥信號(hào)被輔料信號(hào)覆蓋的問題。

圖3 弱主藥信號(hào)藥品及乳糖的拉曼光譜（A）與紅外光譜（B）

Fig.3 Raman spectra （A） and infrared spectra （B） of weak active pharmaceutical ingredient （API） signal drugs and lactose

a： 阿司咪唑片； b： 苯磺酸氨氯地平片； c： 鹽酸特拉唑嗪片； d： 鹽酸西替利嗪片； e： 乳糖。

a： Astemizole tablet； b： Amlodipine besylate tablet； c： Terazosin hydrochloride tablet； d： cetirizine hydrochloride tablet； e： lactose.

3.2 銀膠紙制備條件優(yōu)化

3.2.1 銀溶膠表征 DMF溶劑膠的紫外吸收光譜如圖4A。其最大吸收峰在420 nm處，呈單峰且半峰寬較窄，表明此峰為銀納米粒子的等離子共振吸收峰，呈球形均勻分布。掃描電鏡結(jié)果（圖4B）也證明其呈球形均勻分布，且銀納米粒子直徑約為50 nm [13]。

圖4 DMF溶劑膠的紫外-可見吸收光譜（A）及電鏡（B）表征圖

Fig.4 UV-vis spectra （A） and SEM image （B） of silver colloids

圖5 （a） Lee法銀溶膠浸泡的銀膠紙和（b）DMF溶劑膠浸泡的銀膠紙的SERS圖譜

Fig.5 Ag NPs-paper synthesized by Lee method （a） and N，N-dimethylformide （DMF） method （b）

3.2.2 銀溶膠考察 采用Lee法銀溶膠[14]與DMF溶劑膠[15]分別浸泡濾紙相同時(shí)間后，以羅丹明（10

4 g/mL）為探針，在相同檢測(cè)條件下獲得兩種銀膠紙的SERS圖譜（圖5）。由圖5可知， Lee法銀溶膠制備的銀膠紙的增強(qiáng)效果遠(yuǎn)低于DMF溶劑膠制備的銀膠紙，造成該現(xiàn)象可能因?yàn)镈MF溶劑膠在濾紙上沉積量大。SERS檢測(cè)時(shí)，待測(cè)分子與銀納米粒子間距適宜，且均勻分布，才會(huì)有更好的活性及增強(qiáng)效果。如圖6所示，DMF溶劑膠的銀納米粒子在濾紙上沉積量大，且分布均勻（圖6A），而Lee法銀溶膠在濾紙上沉積量較?。▓D6B），故SERS增強(qiáng)效果較差。

圖6 DMF溶劑膠浸泡的銀膠紙（A）與銀溶膠浸泡的銀膠紙（B）的電鏡表征圖

Fig.6 SEM image of Ag NPs-paper synthesized by DMF method （A） and Lee method （B）

3.2.3 浸泡時(shí)間考察 DMF膠浸泡濾紙得到的銀膠紙呈棕色，隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng)，銀膠紙顏色加深，而其增強(qiáng)能力也發(fā)生相應(yīng)變化，本實(shí)驗(yàn)以羅丹明 （10

g/mL）為探針，考察不同浸泡時(shí)間（2， 7， 12， 17， 22， 27和32 h）膠紙的增強(qiáng)能力（圖7A）。選取612 cm

處峰為特征峰，將3次制備的銀膠紙分別進(jìn)行檢測(cè)，以3次峰強(qiáng)的平均值作圖（圖7B），當(dāng)浸泡時(shí)間超過27 h后，增強(qiáng)效果較之前有大幅降低，其原因可能是長(zhǎng)期暴露于空氣中的銀溶膠發(fā)生了氧化或團(tuán)聚，而22 h時(shí)增強(qiáng)效果最佳?？紤]到銀膠紙的增強(qiáng)能力與顏色加深易被激光破壞的特點(diǎn)，最終選擇22 h為最優(yōu)浸泡時(shí)間。

圖7 銀膠紙不同浸泡時(shí)間的增強(qiáng)效果（A）及其散點(diǎn)圖（B）endprint

Fig.7 The enhanced intensity of Ag NPs-paper at different soaking time （A） and its scatterplot （B）

3.3 銀膠紙?jiān)鰪?qiáng)能力考察

3.3.1 銀膠紙與濾紙檢測(cè)結(jié)果比較 以鹽酸西替利嗪片為例，將樣品溶液直接滴加于濾紙上進(jìn)行拉曼檢測(cè)（圖8A），所得拉曼圖譜中只有濾紙背景信號(hào)， 而無(wú)樣品信息。將樣品溶液直接滴加于銀膠紙上進(jìn)行SERS檢測(cè)（圖8B）時(shí)，SERS圖譜中樣品信息得到充分體現(xiàn)。將濾紙與銀膠紙的背景信號(hào)比較，濾紙制備成銀膠紙后，其本身的信號(hào)減少減弱，對(duì)樣品檢測(cè)的干擾也變小。

圖8 普通濾紙（A）與銀膠紙（B）的增強(qiáng)能力

Fig.8 The enhanced intensity of filter paper （A） and Ag NPs-paper （B）

a. 背景信號(hào)； b. 樣品信號(hào)。

a： Background； b： Sample signal.

圖9 濾紙與銀溶膠不同混合方式的增強(qiáng)效果

Fig.9 Intensity of different mixed pattern of paper and Ag NPs-solution

a. 銀溶膠背景信號(hào)； b. 方法三； c. 方法二； d. 方法一。

a： Background signal of Ag NPs， b： method 3， c： method 2， d： method 1.

3.3.2 銀溶膠不同加入方式比較 比較銀溶膠加入方式對(duì)檢測(cè)的影響，方法一是將濾紙浸泡于銀溶膠中制備銀膠紙，再于銀膠紙上滴加樣品溶液進(jìn)行SERS檢測(cè)； 方法二是在濾紙上先滴加銀溶膠， 再滴加樣品溶液進(jìn)行SERS檢測(cè)； 方法三是在濾紙上先滴加樣品溶液， 再滴加銀溶膠進(jìn)行SERS檢測(cè)。

以鹽酸西替利嗪片為例，3種方式所檢測(cè)的結(jié)果如圖9所示，結(jié)果表明，按方法一操作時(shí)，立即可檢測(cè)到樣品信號(hào)， 而無(wú)銀溶膠信息干擾； 但以方法二和方法三操作時(shí)，檢測(cè)多張圖譜后， 只有銀溶膠信號(hào)， 而無(wú)樣品信號(hào)，可能是在這兩種方法中僅通過滴加銀溶膠，在濾紙上沉積的銀納米粒子遠(yuǎn)低于銀膠紙上沉積的銀納米粒子數(shù)，待測(cè)物分子很難與銀納米粒子結(jié)合成有活性的分子以被檢測(cè)。在銀溶膠制備過程中， DMF作為溶劑與還原劑，使得銀溶膠有DMF溶劑背景信號(hào)存在。然而，方法一中的銀膠紙通過浸泡后烘干，同時(shí)使DMF溶劑揮發(fā)，與方法二和方法三中銀溶膠的簡(jiǎn)單滴加而存在的DMF溶劑信號(hào)相比，方法一中以銀膠紙檢測(cè)樣品時(shí)，無(wú)銀溶膠背景峰的干擾。

3.4 SERS檢測(cè)結(jié)果

3.4.1 SERS圖譜的匹配 通過優(yōu)化點(diǎn)樣量與激光功率，選取點(diǎn)樣量10 μL，激光功率180 mW，將滴加于銀膠紙上的樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液立即檢測(cè)，得各自SERS圖譜（圖10），并計(jì)算其相關(guān)系數(shù)，分別為0.9402， 0.9488， 0.9551和 0.9704。可知弱主藥信號(hào)藥品經(jīng)過簡(jiǎn)單的研磨、溶解、離心，排除了輔料干擾，使主藥信號(hào)得以分離，達(dá)到鑒別真?zhèn)蔚哪康摹?/p>

圖10 4種弱主藥信號(hào)藥品的NRS譜（a標(biāo)準(zhǔn)品）與SERS譜（b樣品、c標(biāo)準(zhǔn)品）

Fig.10 Raman spectra （a： standard） and surface enhanced Raman scattering （SERS） spectra （b： sample， c： standard） of four weak API signal drugs

A： 阿司咪唑片； B： 苯磺酸氨氯地平片； C： 鹽酸特拉唑嗪片； D： 鹽酸西替利嗪片。

A： Astemizole tablet； B： Amlodipine besylate tablet； C： Terazosin hydrochloride tablet； D： Cetirizine hydrochloride tablet.

SERS技術(shù)用于檢測(cè)弱主藥信號(hào)藥品具有高靈敏性，此外為了進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)二者檢測(cè)的特征峰進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表1所示。通常SERS位移容差范圍在3個(gè)波數(shù)內(nèi)（≤3 cm

可視為同一個(gè)峰[16]，上述4種藥品與其標(biāo)準(zhǔn)品的SERS圖譜特征峰匹配度極高，可知SERS技術(shù)具有很強(qiáng)的專屬性。同時(shí)，經(jīng)過分離提取后， 弱主藥信號(hào)藥品SERS峰與其標(biāo)準(zhǔn)品NRS特征峰匹配度也很好。

3.4.2 SERS方法精密度考察 為驗(yàn)證所用方法的可靠性，以鹽酸西替利嗪片為例，對(duì)其樣品與標(biāo)準(zhǔn)品平均檢測(cè)6次，并計(jì)算兩者相關(guān)系數(shù)分別為0.9598， 0.9773， 0.9868， 0.9568， 0.9398和0.9425，以相關(guān)系數(shù)差異大小為指標(biāo)，考察方法的精密度。結(jié)果表明， 其RSD為1.9%，能滿足分析要求[17]，且本方法獲得的SERS圖譜的重復(fù)性和重現(xiàn)性良好，亦達(dá)到常規(guī)分析要求。

綜上所述，本研究制備的新型銀膠紙可有效實(shí)現(xiàn)紙基-SERS法對(duì)弱主藥信號(hào)藥品中主藥成分的快速檢測(cè)，其中銀膠紙制備簡(jiǎn)單、攜帶方便、增強(qiáng)能力強(qiáng)，同時(shí)SERS圖譜專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，為藥品監(jiān)管部門檢測(cè)此類藥品提供有力保障，同時(shí)為此類藥品廠家在生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制奠定良好基礎(chǔ)，可見紙基-SERS法在藥品快檢中對(duì)弱主藥信號(hào)藥品檢測(cè)具有廣闊的應(yīng)用前景。

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