何可群

(貴州民族大學化學與環(huán)境科學學院，貴陽 550025)

陰地蕨(Botrychium ternatum)是陰地蕨科陰地蕨屬多年生草本植物，又名肺心草、蕨葉一枝蒿、獨蕨箕、一朵云等［1-4］。陰地蕨以全草入藥，具有清熱解毒、止咳平喘、平肝息風的功效，主治風熱感冒、咽喉腫痛、百日嗽、肺結核、乳腺炎、腮腺炎、小兒驚風、瘡癰腫毒、目生翳障、火眼腫癢等，是我國西南地區(qū)白族、彝族、納西族、苗族等少數民族常用的野生草藥［1-5］。目前對陰地蕨的研究報道還很少，已有的資料表明，陰地蕨的化學成分主要為黃酮、三萜、皂苷、香豆素、揮發(fā)油等，其黃酮類成分為陰地蕨素，槲皮素3-O-α-L-鼠李糖-7-O-β-D-葡萄糖苷及木犀草素等［4-6］。通過文獻檢索，筆者還未見有關陰地蕨中山奈酚的研究報道。本實驗采用高效液相色譜-質譜串聯(HPLC-MS/MS)獲得分子量信息，進而通過與標樣保留時間對比，確定陰地蕨的山奈酚及槲皮素成分，以峰面積對濃度的回歸方程對兩種成分進行定量測定。研究結果可以為該民族藥的進一步開發(fā)及擴大資源利用提供科學依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1200 LC高效液相色譜儀(美國安捷倫儀器有限公司)及API3200 QTRAP MS/MS質譜儀(配ESI源、三重四級桿及線性離子阱，美國 AB SCIEX 公司)，Ecilipse XDB-C18(150 mm ×4.6 mm，5μm)色譜柱(上海笛柏實驗設備有限公司);Agilent 1260 LC高效液相色譜儀，Eclipse plus C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5μm)，G1314F 1260 VWD 可變波長紫外檢測器，數顯恒溫水浴鍋(常州博遠實驗分析儀器有限公司)，METTLERAE240電子分析天平(上海天平儀器廠，感量:0.01 mg)。

1.2 試劑 山奈酚(批號:520-18-3)及槲皮素 (批號:117-39-5)對照品均購自貴州迪大科技有限責任公司。磷酸為優(yōu)級純，甲酸、無水甲醇均為色譜純，濃鹽酸為分析純，所有試劑用超純水配制。陰地蕨樣品購自云南省云龍縣，經貴州民族大學盧文蕓教授鑒定為陰地蕨(Botrychium ternatum)，標本保存于貴州民族大學化學與環(huán)境科學學院藥學教研室。

2 方法與結果

2.1 色譜和質譜條件

2.1.1 HPLC-MS/MS 色譜柱為 Ecilipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫:35 ℃，流動相:甲醇-0.1%甲酸溶液(85∶15)，流速為 1.2 mL·min－1。電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，山奈酚采用MRM模式進行正離子監(jiān)測，噴霧電壓為5.5 kV、離子源溫度600℃，去簇電壓62 V，掃描范圍m/z 50～305。槲皮素采用MRM模式進行負離子監(jiān)測，噴霧電壓為－4.5 kV、離子源溫度 600 ℃，去簇電壓－55 V，掃描范圍m/z 50～305。

2.1.2 定量測定色譜條件 Agilent 1260 LC高效液相色譜儀，Eclipse plus C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(45∶55)，流速0.8 mL·min－1，檢測波長360 nm，柱溫30℃，進樣量10μL。

2.2 對照品儲備液的配制 精密稱取槲皮素、山奈酚對照品各20.00 mg，分別置于50 mL量瓶中，加無水甲醇適量使其溶解，以無水甲醇定容。搖勻，配制成質量濃度均為400μg·mL－1的單一對照品儲備液備用，臨用前稀釋為山奈酚0.800μg· mL－1及槲皮素1.00μg·mL－1濃度供質譜分析。

2.3 供試品溶液制備 將自然晾干的陰地蕨全草在電熱鼓風干燥箱中于(60±1)℃烘干3 h，精確稱取干燥、粉碎(過40目篩)的陰地蕨粉末0.250 g，用80%甲醇溶液20 mL浸泡、75℃水浴回流提取2次，每次1 h，提取結束后，合并提取液、冷卻、濾過。濾液用80%甲醇水溶液補足至40 mL，加鹽酸10 mL，85℃水浴回流酸水解1 h，迅速冷卻，用無水甲醇定容至50 mL，搖勻，臨用前過孔徑 0.45μm 濾膜［7-9］。

2.4 HPLC-MS/MS實驗 取對照品和供試品溶液3μL分別注入 HPLC-MS/MS，得到山奈酚對照品溶液、槲皮素對照品溶液、供試品溶液中的山奈酚及槲皮素的MS譜圖(圖1，2)。在正離子監(jiān)測模式下，山奈酚對照品溶液和供試品溶液對應峰MS譜圖產生5個主要的特征碎片離子 m/z287，185，161，153，121(圖1)，m/s287為山奈酚的［M+H］+峰，證明樣品中含有山奈酚［10-11］;在負離子監(jiān)測模式下，槲皮素對照品溶液和供試品溶液對應峰MS譜圖產生5個主要的特征碎片離子 m/s273，257，239，229，211(圖 2)，m/z301.0為槲皮素的［M+H］+峰，證明樣品中含有槲皮素［10-11］。由于采用負離子監(jiān)測模式，槲皮素的MS圖譜中沒有出現m/z285峰。

2.5 保留時間的確定 將20.00μg·mL－1山奈酚、槲皮素混合對照品溶液按“2.1.2”項色譜條件進樣分析，得到對照品及樣品色譜圖(圖3)。結果陰地蕨供試品出現與混合對照品中山奈酚(18.66 min)、槲皮素(10.11 min)保留時間一致的兩個峰。

2.6 線性關系考察 分別精密吸取質量濃度為400μg·mL－1的山奈酚、槲皮素標準溶液適量，配制成含山奈酚、槲皮素均為 2.50，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00μg·mL－1的混標溶液。以孔徑 0.45μm 濾膜濾過，分別進樣 10μL。在“2.1.2”項色譜條件測定峰面積，以對照品溶液濃度(X，μg·mL－1)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸分析，山奈酚:Y=29.85X－13.24，r=0.999 9;槲皮素:Y=43.86X－24.02，r=0.999 8。結果表明:山奈酚及槲皮素均在2.500～25.000μg·mL－1范圍內呈現良好的線性關系。

圖2 槲皮素對照品溶液(A)和陰地蕨供試品溶液(B)質譜圖Fig.2 ESI-MS spectrum of quercetin standard solution(A)and Botrychium ternatum solution(B)

2.7 精密度實驗 將質量濃度均為20.00μg·mL－1山奈酚、槲皮素混合對照品溶液按“2.1.2”項項色譜條件連續(xù)進樣5次進行分析，以峰面積計算山奈酚及槲皮素的RSD分別為0.98%，0.79%，表明方法精密度良好。

2.8 重復性實驗 取同一批樣品(批號:20140116)5份，按“2.3”項方法制備溶液，按“2.1.2”項色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算山奈酚及槲皮素的平均質量分數，其RSD分別為1.53%和1.82%，表明方法重復性良好。

2.9 穩(wěn)定性實驗 分別在0，2，4，8 h將一供試品溶液按“2.1.2”項下色譜條件進行分析，測定色譜峰面積，計算山奈酚及槲皮素的RSD分別為2.36%，2.19%，表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率實驗 ①精密稱取5份已知含量的樣品(批號:20140116)各0.250 g，分別精密加入山奈酚標準溶液適量;②精密稱取5份已知含量的樣品(批號:20140116)各0.125 g，分別精密加入槲皮素標準溶液適量。分別按“2.3”項下方法制備溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算各成分的量及加樣回收率，結果山奈酚平均加樣回收率98.34%，RSD=1.89%;槲皮素平均加樣回收率98.68%，RSD=2.70%，見表 1。

1.槲皮素;2.山奈酚圖3 混合對照品(A)和陰地蕨(B)的高效液相色譜圖1.quercetin;2.kaempferolFig.3 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Botrychium ternatum(B)

表1 山奈酚和槲皮素加樣回收測定結果Tab.1 Results of recovery tests on on kaempferol and quercetin n=5

2.11 樣品測定 精密稱取3批陰地蕨樣品各3份，每份0.250 g，按“2.3”項下方法制備溶液，按“2.1.2”項色譜條件分別進行分析，測定峰面積，計算各成分的量，結果見表2。

表2 陰地蕨中山奈酚、槲皮素的測定結果Tab.2 Results of content determination on kaempferol and quercetin in Botrychium ternatum n=3

3 討論

研究證實，陰地蕨有顯著的抑制癌細胞增殖及轉移的作用［12］，但迄今為止，其資源還未得到有效的開發(fā)利用，對其化學成分的研究報道也很稀少。筆者在本實驗中用HPLC-MS/MS法對陰地蕨中山奈酚及槲皮素進行鑒定并測定二者的含量，首次報道陰地蕨中的山奈酚成分，實驗結果進一步證實陰地蕨抗菌、抗炎、止咳等功效的物質基礎，可以為該民族藥的藥用價值開發(fā)及擴大資源利用提供一定的科學依據。

［1］云南省衛(wèi)生廳.云南中草藥［M］.昆明:云南人民出版社，1971:365.

［2］大理白族自治州人民政府.大理中藥資源志［M］.昆明:云南民族出版社，1991:64－65.

［3］劉毅，陳羲之.云南常用中草藥單驗方薈萃［M］.昆明:云南科技出版社，2007:6.

［4］國家中醫(yī)藥管理局中華本草編輯委員會.中華本草(第2卷)［M］.上海:上海科學技術出版社，1999:67.

［5］文君，周進康，干正洋.黔產陰地蕨的化學成分預試分析［J］.貴州師范學院學報，2010，26(6):30－32.

［6］齊建紅.陰地蕨屬植物研究進展［J］.西安文理學院學報(自然科學版)，2012，15(2):48－50.

［7］韋文芳.鵝不食草中槲皮素和山奈酚的含量測定［J］.醫(yī)藥導報，2014，33(6):802－804.

［8］吳宏富，黃衛(wèi)平，劉放.高效液相色譜法測定葉酸片的含量與有關物質［J］.醫(yī)藥導報，2014，33(3):389－392.

［9］劉亞蓉.HPLC法同時測定沙棘膏中槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量［J］.藥物分析雜志，2008，28(5):759－761.

［10］郭素華，林珠燦，張志煒.養(yǎng)心草中山奈酚成分的HPLCMS/MS分析及含量測定［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22(6):360－363.

［11］李宇航，戴海學，汪明明，等.槲皮素的電噴霧離子阱質譜分析［J］.質譜學報，2009，30(6):374－378.

［12］王少明，阮君山.陰地蕨對A549腫瘤細胞增殖、黏附及遷移能力的影響［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31(24):2008－2011.