張志濤 劉蕾 邵華

（1.山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院，山東濟(jì)南 250062；

2.濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250062；

3.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250062）

尿液中甲苯二異氰酸酯及其代謝產(chǎn)物的高效液相色譜法測(cè)定

張志濤1，2劉蕾3邵華1

（1.山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院，山東濟(jì)南 250062；

2.濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250062；

3.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250062）

用高效液相色譜法直接測(cè)定尿液中的甲苯二胺和甲苯二異氰酸酯，有效評(píng)價(jià)TDI在體內(nèi)的代謝及殘留。該方法操作簡(jiǎn)便、快捷，無需特殊試劑和設(shè)備。

高效液相色譜；甲苯二胺；甲苯二異氰酸酯；

甲苯二異氰酸酯（Toluene diisocyanate，TDI）應(yīng)用非常廣泛，在高濃度TDI環(huán)境中暴露，對(duì)接觸粘膜有刺激性，可引起哮喘，進(jìn)而可致癌【1】。有實(shí)驗(yàn)證明尿中TDA含量受環(huán)境中TDI暴露濃度高低的影響，二者存在著明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。TDI在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為甲苯二胺（Diaminotoluene，TDA）【2】，可作為研究職業(yè)接觸TDI尿中的生物標(biāo)志物。用TDA作為生物標(biāo)志物多用在檢測(cè)車間空氣中TDI的方法中【3】，但也有人擔(dān)心會(huì)有少量游離TDI未被降解直接排入尿中的可能，故本法使用高效液相色譜法對(duì)尿液標(biāo)本中的TDA及可能存在的TDI進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Aglient 1260高效液相色譜儀，配有G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315D二極管陣列（DAD）檢測(cè)器等；色譜柱：ZORBAX SB-C18柱，4.6×150mm 5μm。津騰抽真空過濾系統(tǒng)。

試劑：pH為7.0的三乙胺磷酸緩沖溶液、色譜純乙腈、甲醇；2，6-TDI標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（TCI公司）；2，4-TDI標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Fluka公司）；2，4-TDA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（東京TRC公司）；2，6-TDA（東京TRC公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

流速：1.0mL·min-1

進(jìn)樣量：5μL

二極管陣列掃描，選擇最優(yōu)波長(zhǎng)

柱溫箱：30℃

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：

（1）2，4-TDA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取0.0537g的2，4-TDA，用色譜甲醇溶解并定容至50mL，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.074mg·mL-1。

（2）2，6-TDA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取0.0582g的2，6-TDA，用色譜甲醇溶解并定容至50mL，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.164 mg·mL-1。

（3）2，4-TDI標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取0.0657g的2，4-TDI，用色譜甲醇溶解并定容至50mL，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.314 mg·mL-1。

（4）2，6-TDI標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取0.0653g的2，6-TDI，用色譜甲醇溶解并定容至50mL，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.306 mg· mL-1。

圖1

（5）2，4-TDA、2，6-TDA、2，4-TDI和2，6-TDI混標(biāo)：分別量取上述四種標(biāo)準(zhǔn)液5.00mL，置于同一容量瓶中，用色譜甲醇稀釋并定容于50mL，制得混標(biāo)濃度分別為：107.1μg·mL-1、116.4μg· mL-1、131.4μg·mL-1和130.6μg·mL-1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)系列的制備

按照WST 68-1996《研制生物樣品監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)方法指南》的要求準(zhǔn)備好收集的尿液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，于10000r·min-1離心后備用。

準(zhǔn)確吸取取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1，2，3，5mL，用處理好的尿液稀釋并定容至50mL.制成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度見表1.

表1

1.5 測(cè)定

采集的尿液樣品于10000r·min-1離心后，用三乙胺緩沖液和乙腈做流動(dòng)相，根據(jù)TDA和TDI的化學(xué)性質(zhì)優(yōu)化HPLC流動(dòng)相梯度條件對(duì)離心后的尿樣進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)同一基體中的四種成分定性，根據(jù)保留時(shí)間用單組份標(biāo)準(zhǔn)溶液確定混合標(biāo)準(zhǔn)液的色譜峰，根據(jù)出峰順序，分別為2，6-TDA，2，4-TDA，2，6-TDI，2，4-TDI。見圖1

2.2 運(yùn)用3D光譜圖（見圖2）發(fā)現(xiàn)從190nm—400nm的DAD的響應(yīng)值逐漸減弱，在234nm時(shí)，靈敏度最佳，但由于干擾峰也相應(yīng)增多，故選擇更為理想的240nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。見圖2

圖2

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限測(cè)定方法指南要求色譜法做3個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，本方法加了一個(gè)高濃度，做4個(gè)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按回歸方程作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；以3倍的噪聲水平與回歸方程斜率的比值作為檢出限。見表2

表2

甲苯二胺和甲苯二異氰酸酯在2-10μg/mL的范圍里均有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度取標(biāo)準(zhǔn)曲線的3種濃度測(cè)定。由表3結(jié)果可知，4種成分3種濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.1%-4.9%（要求控制在5%以內(nèi)）。

表3

2.5 回收率測(cè)定在對(duì)已知含量的樣品中加入3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收試驗(yàn)，其平均回收率為96.1%-102.3%（價(jià)表回收率要求95%-105%）。

3 結(jié)語

在實(shí)驗(yàn)室配備高效液相色譜儀常規(guī)儀器及配件的前提下，本方法通過簡(jiǎn)單的前處理過程，能對(duì)TDA和TDI的進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，由于兩種物質(zhì)的同分異構(gòu)體能夠完全分離，故可以達(dá)到同時(shí)對(duì)四種不同結(jié)構(gòu)同時(shí)檢測(cè)的效果。

［1］Pernilla Lind et al.Toxicokinetics of 2，4-and，6-toluene?diamine inhydrolysed urine and plasma after occupational exposure to 2，4-and 2，6-toluene diisocyanate.Occupational and Environ?mental Medicine 1996；53：94-99.

［2］Katja K??ri? et al.Exposure to 2，4-and 2，6-toluene diiso?cyanate（TDI）during production of flexible foam：determination of airborne TDI and urinary 2，4-and 2，6-toluenediamine（TDA）.The Analyst 2001，Vol.126（7），pp.1025-31.

［3］管健，吳小瓊，朱國英等GC-MS法測(cè)定車間空氣中甲苯二異氰酸酯探討［J］中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20（5）：998-1000.

Determination of TDA and TDI in urine by high performance liquid chromatograph.This method is simple，rapid and need not Special reagent and equipment.

High performance liquid chromatography；TDA；TDI

張志濤（1979—），男，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所助理研究員，本科。

邵華