陳　蓉，吳啟南（.蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州2504；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京20046）

芡實(shí)種皮多酚抗疲勞耐缺氧作用研究

陳蓉1，吳啟南2，*
（1.蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215104；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046）

目的：研究芡實(shí)種皮多酚的抗疲勞耐缺氧作用。方法：將昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、陽(yáng)性對(duì)照組（維生素E，50 mg/kg·d-1）、多酚高（400 mg/kg·d-1）、中（200 mg/kg·d-1）、低劑量組（100 mg/kg·d-1），分別灌胃給藥，每日1次，連續(xù)5 d，觀察芡實(shí)種皮多酚對(duì)小鼠體重、負(fù)重游泳時(shí)間、常壓耐缺氧時(shí)間、肝糖原、肌糖原、乳酸脫氫酶、血尿素氮和組織一氧化氮的含量，以及免疫器官指數(shù)變化的影響。結(jié)果：高、中、低劑量種皮多酚均能延長(zhǎng)負(fù)重小鼠游泳時(shí)間和常壓密閉耐缺氧時(shí)間，顯著提高了小鼠的抗應(yīng)激能力（p＜0.05）。其活動(dòng)量、食量、精神狀態(tài)、日均體重增加量、臟器系數(shù)得到提升。同時(shí)，芡實(shí)種皮多酚提高了疲勞小鼠肝糖原、肌糖原儲(chǔ)備，降低了血清尿素氮水平，提高了血清和肝臟中乳酸脫氫酶含量，增加了血清中一氧化氮含量。結(jié)論：芡實(shí)種皮多酚具有抗疲勞和提高耐缺氧能力的作用。

芡實(shí)種皮，多酚，抗疲勞，耐缺氧

芡實(shí)為睡蓮科植物芡（Euryale ferox Salisb）的干燥成熟種仁［1］。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［2］，具有益腎固精，補(bǔ)脾止瀉，祛濕止帶的功效，是藥食兩用的佳品。產(chǎn)地加工后的余料芡實(shí)種皮數(shù)量大，但利用率低，常作為秋收后的廢物被丟棄，容易造成環(huán)境污染。種皮中富含多酚，具有一定的生物活性，可作為天然植物栲膠的來(lái)源［3］。目前，對(duì)芡實(shí)的藥效學(xué)研究多為多糖和黃酮類(lèi)成分［4-5］，種皮多酚的活性研究較少。多酚類(lèi)物質(zhì)具有多種藥理作用，能夠抗氧化［6］、抗腫瘤［7］、保護(hù)心血管系統(tǒng)［8］、保護(hù)腦及神經(jīng)系統(tǒng)［9］以及緩解體力疲勞［10］。

疲勞分為兩種：軀體性疲勞和精神性疲勞［11］，抗疲勞就是延緩疲勞的產(chǎn)生和加速疲勞的消除。目前評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)性疲勞的方法普遍應(yīng)用的主要有耐力實(shí)驗(yàn)與生化檢測(cè)。游泳時(shí)間長(zhǎng)短反映了運(yùn)動(dòng)耐力的大小，而運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)的最直接表現(xiàn)［12］。缺氧對(duì)機(jī)體是一種劣性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是氧化供能，最終導(dǎo)致機(jī)體心腦等重要器官因供氧不足而死亡。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠游泳時(shí)間作為判斷耐力程度的客觀指標(biāo)來(lái)間接反映機(jī)體的抗疲勞能力，通過(guò)常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)判斷小鼠的抗應(yīng)激能力，以維生素E作為陽(yáng)性對(duì)照藥［13］，對(duì)芡實(shí)種皮多酚進(jìn)行小鼠抗疲勞耐缺氧研究，為開(kāi)發(fā)新型食品保健品提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

芡實(shí)種皮多酚南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制（磷鉬鎢酸顯色法測(cè)得含量為113.30 mg/g）［3］；昆明小鼠體重18～22 g，環(huán)境適應(yīng)1周，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005；氯化鈉注射液安徽豐原藥業(yè)股份有限公司；鈉石灰上海陸都化學(xué)試劑廠；天然維生素E海南養(yǎng)生堂藥業(yè)有限公司；乳酸脫氫酶試劑盒（批號(hào)：20110412）、一氧化氮試劑盒（批號(hào)：20110322）、尿素氮試劑盒（批號(hào)：20110319）、肝糖原/肌糖原試劑盒（批號(hào)：20110329） 購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

FSH-2A可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī)金壇市金南儀器廠；universal-32R高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Hettich公司；LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機(jī)南京曉曉?xún)x器設(shè)備有限公司；Powerwave X340全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Tek公司；HH-S電熱恒溫水浴箱鞏義市英峪予華儀器廠；WH-90A微型漩渦混懸器上海振榮科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組與喂養(yǎng)取健康小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分成5組：對(duì)照組，灌服生理鹽水；VE組（陽(yáng)性對(duì)照），灌服VE生理鹽水溶液50 mg/kg·d-1；芡實(shí)種皮多酚高劑量組，灌服多酚生理鹽水溶液400 mg/kg·d-1；芡實(shí)種皮多酚中劑量組，灌服多酚生理鹽水溶液200 mg/kg·d-1；芡實(shí)種皮多酚低劑量組，灌服多酚生理鹽水溶液100 mg/kg·d-1。

1.2.2一般情況的測(cè)定保持室溫25℃，相對(duì)濕度50%，按時(shí)給藥，自由進(jìn)食，觀察給藥期間各組小鼠飲食、排泄情況，給藥前及處死前分別稱(chēng)重，分析體重變化，計(jì)算增長(zhǎng)率［14］。

1.2.3負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)每組隨機(jī)抽取12只小鼠，共60只，連續(xù)灌胃5 d，末次給藥30 min后，將小鼠尾部系上相當(dāng)于其體重5%的重物，置于水槽中（30 cm× 30 cm×50 cm），水深40 cm，水溫25℃，記錄小鼠自游泳開(kāi)始至頭部沉入水中8 s不能浮出水面的時(shí)間，即為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間［15］，并計(jì)算延長(zhǎng)率。

1.2.4常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)每組隨機(jī)抽取12只小鼠，共60只，連續(xù)灌胃5 d，末次給藥1 h后，將小鼠放入盛有5 g鈉石灰的250 mL廣口瓶中，瓶口涂抹凡士林密封，立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠存活時(shí)間［16］。

1.2.5肝糖原和肌糖原含量的測(cè)定每組隨機(jī)抽取12只小鼠，共60只，連續(xù)灌胃5 d，末次給藥24 h后，將小鼠投入水槽游泳，平均15 min后撈出，放置10 min后，眼眶取血，處死，迅速取其肝臟和肌肉組織，用生理鹽水漂凈，濾紙吸干，取0.5 g，加入5%三氟乙酸2 mL，勻漿，3500 r/min離心15 min后，分別取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法，測(cè)定肝糖原和肌糖原含量［17］。

1.2.6乳酸脫氫酶（LDH）和尿素氮（BUN）含量的測(cè)定取1.2.5下小鼠，眼眶取血，所得血液樣本于冰箱靜置后，3500 r/min離心15 min分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法，測(cè)定血清LDH和BUN含量。取血后處死，迅速取其肝臟組織，用生理鹽水漂凈，濾紙吸干，取0.5 g，勻漿，3500 r/min離心15 min后，分別取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法，測(cè)定肝組織LDH含量［18］。

1.2.7一氧化氮（NO）含量的測(cè)定取1.2.5下小鼠，取血后處死，迅速取其肝臟、腦、心肌組織，用生理鹽水漂凈，濾紙吸干，取0.5 g勻漿，3500 r/min離心15 min后，分別取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法，測(cè)定肝臟、腦、心肌組織NO含量。

1.2.8免疫器官指數(shù)測(cè)定取1.2.5下小鼠，取血后處死，迅速取出肝、心、脾、腦，生理鹽水漂凈，濾紙吸干，修去脂肪、系膜，稱(chēng)重。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，組間比較采用T檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析（One way ANOVA），檢測(cè)的顯著水平為α=0.05或α=0.01，用“*”及“**”標(biāo)記顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1對(duì)小鼠表現(xiàn)狀態(tài)的影響

各組小鼠精神狀態(tài)較好，色光滑，飲食、大小便無(wú)異常，提示芡實(shí)種皮多酚有助于提高小鼠活動(dòng)力。由表1可知，各組體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，多酚高劑量組增重顯著（p＜0.05），其余各組日增重量未表現(xiàn)出顯著性差異（p＞0.05）。表明中低劑量芡實(shí)種皮多酚無(wú)明顯增加小鼠體重的作用。

表1　芡實(shí)種皮多酚對(duì)小鼠體重的影響（n=12，x±s）Table 1　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on body weigh（tn=12，x±s）

表2　芡實(shí)種皮多酚對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響（n=12，x±s）Table 2　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on swimming time（n=12，x±s）

2.2對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響

由表2可以看出，各劑量多酚組小鼠游泳耐力均高于空白組（p＜0.05），并且在一定范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間延長(zhǎng)。說(shuō)明一定濃度的種皮多酚能增強(qiáng)小鼠游泳耐力，能對(duì)抗小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞，防止運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的氧化損傷。與空白組比較，VE組亦能極顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間（p＜0.01）。

表3　芡實(shí)種皮多酚對(duì)小鼠常壓耐缺氧的影響（n=12，x±s）Table 3　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on hypoxia tolerance time（n=12，x±s）

2.3對(duì)小鼠常壓耐缺氧能力的影響

從表3可以看出，多酚組、VE組與空白組相比，小鼠耐缺氧存活時(shí)間均延長(zhǎng)了25%以上，達(dá)到了極顯著水平（p＜0.01）。種皮多酚中劑量組延長(zhǎng)率更高，達(dá)到了60.65%，明顯高于VE組；低劑量組也與陽(yáng)性組相當(dāng)。提示芡實(shí)種皮多酚能夠提高小鼠的耐缺氧能力，對(duì)機(jī)體在應(yīng)激條件下減少傷害有積極作用。

表4　芡實(shí)種皮多酚對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原和肌糖原的影響（n=12，x±s）Table 4　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on the contant of muscle and liver glycogen（n=12，x±s）

2.4對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

從表4可知，不同劑量的芡實(shí)種皮多酚對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠的肝糖原和肌糖原影響不同。與空白組相比，多酚高、中、低劑量組能極顯著提高小鼠的肝糖原水平（p＜0.01），并且優(yōu)于VE組。而對(duì)肌糖原的影響，各組差別較大，多酚高劑量組、VE組顯著高于空白組肌糖原水平（p＜0.05），多酚中劑量組和低劑量組均低于空白組，但未呈顯著性差異（p＞0.05）。進(jìn)食后過(guò)多的糖可在肝臟和肌肉中合成糖原儲(chǔ)存起來(lái)，以免血糖過(guò)高。上述結(jié)果提示，芡實(shí)種皮多酚可促進(jìn)其糖原合成，特別是提高了肝糖原的儲(chǔ)存能力，對(duì)維持血糖相對(duì)恒定十分有利。當(dāng)肌肉活動(dòng)劇烈時(shí)，肌糖原分解成大量的乳酸，而大量的芡實(shí)種皮多酚能使得肌糖原儲(chǔ)存能力加強(qiáng)，延長(zhǎng)了運(yùn)動(dòng)時(shí)間，也節(jié)省了本身的肌糖原。

表5　芡實(shí)種皮多酚對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠LDH和BUN含量的影響（n=12，x±s）Table 5　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on LDH and BUN conten（tn=12，x±s）

2.5對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠乳酸脫氫酶（LDH）和血清尿素氮（BUN）含量的影響

從表5中可以看出，與空白組相比，灌服芡實(shí)種皮多酚、VE的小鼠血清LDH、肝臟LDH活力都有不同程度的增加。運(yùn)動(dòng)后小鼠的血清BUN與空白組相比，都有不同程度的降低，其中多酚高劑量組表現(xiàn)出了極顯著差異（p＜0.01）。LDH能有效地加速清除運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生的乳酸，BUN隨機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)力增強(qiáng)而減少，提示芡實(shí)種皮多酚有提高機(jī)體LDH降低血清BUN的功能，對(duì)恢復(fù)機(jī)體體力十分有利，從而提高了機(jī)體抗疲勞作用。

2.6對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠組織一氧化氮（NO）含量的影響

NO是近年來(lái)生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最熱點(diǎn)的課題之一，與心血管、神經(jīng)、胃腸、泌尿、免疫系統(tǒng)、腎病、肝病、糖尿病、腫瘤、創(chuàng)傷、感染、器官移植排斥反應(yīng)和性功能調(diào)控等都有密切關(guān)系［19-20］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表6），與空白組相比，芡實(shí)種皮多酚組、VE組肝、腦、心組織NO含量均有一定提高，其中中劑量組表現(xiàn)最優(yōu)，提示對(duì)NO的調(diào)節(jié)作用可能與給藥劑量不呈線性關(guān)系，中劑量組可能接近促進(jìn)NO提高的最佳劑量。中劑量組心組織NO含量極顯著高于空白組（p＜0.01），中、低劑量組腦組織NO含量也比空白組有顯著提高（p＜0.05），但高劑量多酚組對(duì)肝組織NO含量影響不明顯。提示芡實(shí)種皮多酚輔助提高組織中一氧化氮合酶活性，減少長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心腦組織NO含量的降低。

表6　芡實(shí)種皮多酚對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠不同組織NO的影響（n=12，x±s）Table 6　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on tissue NO conten（tn=12，x±s）

2.7對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表7），芡實(shí)種皮多酚高、中、低劑量組、VE組與空白組比較，肝、心、脾、腦等主要臟器系數(shù)均無(wú)顯著差異（p＞0.05），表明芡實(shí)種皮多酚和VE對(duì)小鼠主要臟器無(wú)明顯增重作用。

表7　芡實(shí)種皮多酚對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響（n=12，x±s）Table 7　Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on the organ coefficien（tn=12，x±s）

3　結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以生理鹽為水空白對(duì)照、VE為陽(yáng)性對(duì)照，考察芡實(shí)種皮多酚是否具有抗疲勞和提高耐缺氧能力。結(jié)果表明，與空白組相比，高、中、低劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和常壓密閉耐缺氧時(shí)間均延長(zhǎng)，顯著提高了小鼠的抗應(yīng)激能力，在文獻(xiàn)報(bào)道［21-22］傳統(tǒng)芡實(shí)藥材及其不同提取部位具有抗氧化作用的基礎(chǔ)上更進(jìn)一步。給以多酚的各組小鼠，其活動(dòng)能力、食量、精神狀態(tài)、日均體重增加量、肝臟和心臟臟器系數(shù)均有一定提升。同時(shí)，芡實(shí)種皮多酚提高了疲勞小鼠肝糖原、肌糖原儲(chǔ)備、降低了血清尿素氮水平、提高了血清和肝臟中乳酸脫氫酶含量、增加了血清中一氧化氮含量。證實(shí)芡實(shí)種皮多酚確實(shí)具有調(diào)節(jié)生理生化功能的作用。

天然來(lái)源的中藥由于其副作用少，不含對(duì)人體有害的興奮劑而成為近年來(lái)抗疲勞研究的熱點(diǎn)。芡實(shí)廢棄物種皮除作為染料外，還具備生物活性。參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》［23］中緩解體力疲勞功能和提高缺氧耐受力判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可初步判定芡實(shí)種皮多酚具有抗疲勞耐缺氧作用，其機(jī)制可能是通過(guò)增加機(jī)體能源儲(chǔ)備、改善缺氧、及時(shí)消除疲勞產(chǎn)物加速疲勞消除。因此，今后在此基礎(chǔ)上可以從抗氧化、能量代謝及分子生物學(xué)等多方面深入研究，以期能為新型食品保健品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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Effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on anti-fatigue and hypoxia tolerance

CHEN Rong1，WU Qi-nan2，*
（1.Suzhou Institute for Food and Drug Control，Suzhou 215104，China；2.College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China）

Objective：To observe the effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on anti-fatigue，hypoxia tolerance in mice.Methods：Kunming mice were randomly divided into blank group，positive control group（vitamin E，50 mg/kg·d-1），and polyphenols high-dose（400 mg/kg·d-1），medium-dose（200 mg/kg·d-1），lowdose（100 mg/kg·d-1）group，all mice were administered by intragastric administration，once a day for 5 consecutive days.Then，effect of Semen Euryales seed coat polyphenols on mice body weight，weight loading swimming ability，time of bearing hypoxia at normal pressure，hepatic glycogen，muscle glycogen，lactate dehydrogenase，blood urea nitrogen，tissue nitric oxide content and immune organ index.Results：Polyphenols group of high，medium，low dose could extend mice swimming time and hypoxia tolerance time，enhance antistress ability evidently（p＜0.05）.In addition，activity，appetite，mental state，average daily weight increase and immune organ index were improved.Polyphenols could increase hepatic glycogen，muscle glycogen reserve，serum LDH content，tissue and serum NO content，decrease serum BUN content.Conclusion：Semen Euryales seed coat polyphenols showed the effect of anti-fatigue and enhancing hypoxia tolerance.

Semen Euryales seed coat；polyphenols；anti-fatigue；hypoxia tolerance

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0100-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.012

2015－05－11

陳蓉（1986-），女，碩士，主管中藥師，研究方向：中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)，E-mail：kedingyu@126.com。

吳啟南（1963-），男，教授，研究方向：中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)，E-mail：qnlxw@yahoo.com.cn。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI04B06）。