張麗君 王峰 莫俊鑾 彭毅

深圳市頭孢曲松低敏淋病奈瑟菌株耐藥基因分析

張麗君 王峰 莫俊鑾 彭毅

目的 了解penA、ponA、porB和mtrR突變與深圳市淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性降低的相關(guān)性。方法 收集2009—2011年深圳市淋球菌臨床分離株296株，采用瓊脂稀釋法篩選出頭孢曲松低敏株［MIC（0.06～0.50）μg/ml］53株。將頭孢曲松低敏菌株以及按照1∶1抽樣原則隨機(jī)抽取的53株高敏菌株，共計(jì)106株淋球菌作為試驗(yàn)菌株。對(duì)所有菌株penA、ponA、porB和mtrR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及DNA測(cè)序分析。結(jié)果1株淋球菌的青霉素結(jié)合蛋白2（penicillin-binding protein 2，PBP2，由penA基因編碼）具有鑲嵌樣結(jié)構(gòu)（MIC 0.125 0 μg/ml），對(duì)剩余105株淋球菌PBP2的氨基酸序列分析，共得到16個(gè)不同的氨基酸模式。模式ⅩⅢ、ⅩⅧ、ⅩⅩⅩⅧ對(duì)應(yīng)的頭孢曲松MIC值相對(duì)較高（MIC50均為0.062 5 μg/ml），而模式Ⅱ的頭孢曲松MIC值相對(duì)較低（MIC50為0.008 0 μg/ml）。mtrR、porB以及ponA突變?cè)陬^孢曲松低敏組和高敏組中的發(fā)生率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論 PBP2鑲嵌樣結(jié)構(gòu)可能不是深圳市淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性降低的主要原因，非鑲嵌樣PBP2 500～580位多個(gè)氨基酸突變產(chǎn)生的不同氨基酸模式聯(lián)合mtrR、porB以及ponA突變?cè)谡T導(dǎo)淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性降低中可能有意義。

淋病奈瑟球菌；頭孢曲松；DNA突變分析；微生物敏感性試驗(yàn)；抗藥性，微生物

淋病是我國(guó)主要的性傳播疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年全國(guó)淋病發(fā)病達(dá)91853例，其中廣東省以16.77/10萬(wàn)的發(fā)病率在全國(guó)31個(gè)省自治區(qū)直轄市中位居第三［1］。頭孢曲松作為我國(guó)治療淋病的首選藥物之一，臨床雖少見治療失敗的病例，但頭孢曲松低敏淋球菌菌株的出現(xiàn)，應(yīng)引起重視。頭孢曲松屬于β內(nèi)酰胺類抗生素，具有良好的親水性，易透過(guò)細(xì)菌外膜的膜孔，作用于青霉素結(jié)合蛋白（penicillin-binding protein，PBP）靶位。淋球菌對(duì)頭孢曲松耐藥主要由染色體介導(dǎo)，多數(shù)研究主要關(guān)注3個(gè)方面：①抗生素作用靶位點(diǎn)的改變，主要是penA基因編碼的PBP2以及ponA基因編碼的PBP1改變，影響抗生素與淋球菌的結(jié)合產(chǎn)生耐藥；②porB基因編碼細(xì)菌細(xì)胞膜孔蛋白的改變，導(dǎo)致膜通透性降低產(chǎn)生耐藥；③mtrR外排系統(tǒng)的改變，導(dǎo)致細(xì)菌外排作用增強(qiáng)產(chǎn)生耐藥。我們對(duì)2009—2011年淋球菌臨床分離株penA、ponA、porB和mtrR基因進(jìn)行分析，試圖了解本市淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性降低的分子機(jī)制。

材料和方法

1.菌株來(lái)源：所有淋球菌菌株均來(lái)自2009—2011年深圳市淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。從全市5個(gè)區(qū)的34家規(guī)范化性病實(shí)驗(yàn)室中抽取16家作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)收集樣本,收集時(shí)間為每年的7～10月份，收集對(duì)象為門診就診的疑似淋病患者。樣本經(jīng)革蘭染色涂片鏡檢、Thayer Martin（TM）培養(yǎng)基分離培養(yǎng)純化、氧化酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)鑒定后洗脫于脫脂牛奶中，-70℃低溫保存。

2.藥敏試驗(yàn)：所有菌株按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)［2］經(jīng)瓊脂稀釋法測(cè)定頭孢曲松的最小抑菌濃度（MIC）。每批試驗(yàn)均由標(biāo)準(zhǔn)菌株（WHO G、WHO L、WHO J、ATCC 49226）作質(zhì)控。

3.菌株篩選：按照WHO西太平洋區(qū)耐藥監(jiān)測(cè)指南的解釋標(biāo)準(zhǔn)［3］，篩選頭孢曲松低敏［MIC（0.06～0.50）μg/ml］淋球菌菌株，按照1∶1抽樣原則隨機(jī)抽?。⊿PSS 17.0軟件）等量高敏（MIC≤0.03 μg/ml）淋球菌菌株，作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行penA、ponA、porB和mtrR基因分析。

4.DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序：采用QIAamp? DNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行DNA提取；由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成引物分別對(duì)penA（2 040 bp）［4］、ponA（205 bp）［5］、porB（754 bp）［6］和mtrR（401 bp）［5］基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序。

5.penA、ponA、porB和mtrR氨基酸序列分析：利用MEGA 4軟件將序列拼接后與標(biāo)準(zhǔn)株FA 1090的相關(guān)基因進(jìn)行比對(duì)分析，分析可能存在的突變位點(diǎn)；同時(shí)將PBP2的氨基酸序列與青霉素敏感的淋病奈瑟菌（LM 306）、腦膜炎奈瑟菌（MC 58）、多糖奈瑟菌（NCTC 11858）、灰色奈瑟菌（NCTC 10294）、深黃/干燥奈瑟菌（1654/1659）、灰質(zhì)奈瑟菌（NCTC8263）的PBP2比較，分析可能存在的鑲嵌樣結(jié)構(gòu)；利用Cn3D 4.1軟件以PBP2晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，分析氨基酸突變［4-6］。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)突變位點(diǎn)與淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性降低的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，α=0.05。

結(jié)果

1.藥敏試驗(yàn)結(jié)果：共收集296株淋球菌，未發(fā)現(xiàn)頭孢曲松耐藥菌株，頭孢曲松低敏菌株有53株，低敏率為17.91%（53/296）。

2.PBP2氨基酸模式分析：106株淋球菌臨床分離株的PBP2氨基酸序列分析，共得到17個(gè)不同模式。其中，氨基酸模式X具有鑲嵌樣結(jié)構(gòu)僅包含1株菌株，該株菌的頭孢曲松MIC值為0.125 μg/ml。剩余16個(gè)非鑲嵌樣結(jié)構(gòu)模式中，模式ⅩⅧ數(shù)量最多為23株，其次為模式ⅩⅢ22株，模式ⅩⅩⅩⅧ13株，模式Ⅱ12株，模式ⅩⅪ10株?？偟膩?lái)說(shuō)，包含菌株數(shù)量較多的氨基酸模式對(duì)應(yīng)的頭孢曲松MIC值分布具有多樣性，其中模式ⅩⅢ、ⅩⅧ、ⅩⅩⅩⅧ對(duì)應(yīng)的頭孢曲松MIC值相對(duì)較高（MIC50均為0.062 μg/ml），而模式Ⅱ所含菌株對(duì)應(yīng)的頭孢曲松MIC值相對(duì)較低（MIC50為0.008 μg/ml）。見表2。

3.PBP2突變位點(diǎn)分析：具有鑲嵌樣結(jié)構(gòu)的氨基酸模式X與LM 306（基因庫(kù)編號(hào)M32091）相比，共有59個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變，大部分位點(diǎn)位于青霉素轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域（81.4%，48/59），其改變了氨基酸片段與多糖奈瑟菌、灰色奈瑟菌、深黃/干燥奈瑟菌PBP2重組后的特異性片段的一致性高達(dá)88.1%（52/59）。除氨基酸模式X外，其余16個(gè)模式共發(fā)現(xiàn)15位氨基酸位點(diǎn)的改變，分別是插入突變345D、 573N，置換突變 A501，F(xiàn)504，A510，A516，H541，G542，V548，P551，P552，K555，I556，I566，A574，其中345 D以及A510V、A516G的發(fā)生率均為100%，大部分的氨基酸突變存在于PBP2轉(zhuǎn)肽酶的500～557位氨基酸。MIC值相對(duì)較高的三個(gè)模式均存在501位點(diǎn)的氨基酸突變，而MIC值相對(duì)較低的模式Ⅱ不存在。具有A501突變的78株淋球菌菌株頭孢曲松MIC值的分布為（0.002～0.500）μg/ml，隨MIC值的增加，其置換率也在上升，3株頭孢曲松MIC值為0.5 μg/ml的菌株均具有A501和P551突變。A501突變?cè)陬^孢曲松低敏株中（82.7%，43/52）和高敏株中（66.0%，35/53）的發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.811，P＞0.05）。而具有H541突變的13株菌頭孢曲松MIC值的分布為（0.002～0.250）μg/ml，隨MIC值的增加，其突變率在降低，該突變?cè)陬^孢曲松低敏株中（5.8%，3/52）和高敏株中（18.9%，10/53）的發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.151，P＜0.05）。其他突變位點(diǎn)未觀察到類似的趨勢(shì)變化。見表3。

表2 不同PBP2氨基酸模式菌株對(duì)應(yīng)的頭孢曲松最小抑菌濃度（MIC）分布（菌株數(shù)）

表3 含不同氨基酸突變位點(diǎn)菌株對(duì)應(yīng)的頭孢曲松最小抑菌濃度（MIC）分布（菌株數(shù)）

Cn3D 4.1軟件對(duì)PBP2的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其中A501突變靠近β內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合區(qū)，P551、G542以及H541突變則距離β內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合區(qū)較遠(yuǎn)。

4.mtrR、porB和ponA突變分析：106株菌的mtrR、porB和ponA突變?cè)陬^孢曲松低敏株與高敏株中未見明顯差異。除1株高敏株外，105株菌ponA基因編碼的PBP1均存在L421P突變。99株菌porB基因編碼孔蛋白的101和102位點(diǎn)存在非同義置換，在低敏株中，以G101K和A102D最多見（31/53，58.5%），其次為G101D（14/53，8.5%），G101K和A102G（3/53，11.3%），G101K和A102N（3/53，11.3%）。高敏株中分別為G101K和A102D（26/53，58.5%），G101D（16/53，8.5%），G101K和A102G（5/53，11.3%），G101K和A102N（1/53，11.3%）。101和102位點(diǎn)的突變模式在低敏株與高敏株間的發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

共94株菌在mtrR啟動(dòng)子區(qū)的反向重復(fù)序列中存在單核苷酸（A）缺失突變，其中低敏株49株（49/ 53，92.5%），高敏株45株（45/53，84.9%）。54株菌在mtrR編碼區(qū)具有A39T或者G45D突變，其中低敏株 24株（24/53，45.3%），高敏株 30株（30/53，56.6%）。兩處突變?cè)诘兔糁旰透呙糁曛邪l(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

討論

penA、mtrR、porB、ponA 4個(gè)基因中，關(guān)注最多的是penA基因改變引起的PBP2氨基酸序列的改變。PBP2由penA基因（全長(zhǎng)1 752 bp）編碼，其單體由兩個(gè)決定域組成，PBP二聚化決定域（71～221殘基）和PBP轉(zhuǎn)肽酶決定域（263～557殘基）［7］。研究認(rèn)為PBP2轉(zhuǎn)肽酶決定域的鑲嵌樣結(jié)構(gòu)［8-9］參與誘導(dǎo)淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性的降低以及對(duì)頭孢曲松的高度耐藥。但是，我們并未得出相似結(jié)論，106株淋球菌PBP2分析僅發(fā)現(xiàn)1株菌具有鑲嵌樣結(jié)構(gòu)（MIC為0.125 μg/ml），該菌的鑲嵌樣結(jié)構(gòu)是由與多糖奈瑟菌、灰色奈瑟菌、深黃/干燥奈瑟菌以及淺黃奈瑟菌相似的片段組成，其氨基酸模式與日本和澳大利亞之前報(bào)道［10-11］的對(duì)頭孢曲松低敏的菌株的鑲嵌樣結(jié)構(gòu)模式X的序列一致，并不含有345位點(diǎn)的氨基酸插入，表明其結(jié)構(gòu)并不是由氨基酸插入或置換引起，而由鄰近物種淺黃奈瑟菌、灰色奈瑟菌等對(duì)青霉素天然耐藥的共生細(xì)菌將耐藥基因部分或全部水平傳遞給病原菌所形成。由于本次研究?jī)H發(fā)現(xiàn)1株菌具有鑲嵌樣結(jié)構(gòu)，因此我們推測(cè)鑲嵌樣結(jié)構(gòu)并不是導(dǎo)致深圳市淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性下降的主要原因［12］，PBP2非鑲嵌樣結(jié)構(gòu)的改變可能具有更重要的意義。值得一提的是，對(duì)該菌株的多抗原序列分型（N.gonorrhoeae-multi antigen sequence typing，NG-MAST）結(jié)果顯示該型別（ST 5308）被香港報(bào)道過(guò)［13］，考慮到深圳與香港毗鄰，人員交往密切以及該株菌對(duì)頭孢曲松較高的MIC值，也應(yīng)引起我們的重視。

對(duì)剩余105株淋球菌非鑲嵌樣結(jié)構(gòu)的PBP2進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)16個(gè)不同的氨基酸模式，包括9個(gè)已被報(bào)道［7-8］的和7個(gè)新發(fā)現(xiàn)的，表明深圳市頭孢曲松低敏淋球菌菌株的PBP2蛋白存在較高的多樣性，這可能與菌株本身具有的高多態(tài)性有關(guān)。大部分包含菌株數(shù)量較多的氨基酸模式對(duì)應(yīng)頭孢曲松的MIC值范圍較廣，僅少量模式與頭孢曲松的MIC值相關(guān)。主要的6個(gè)氨基酸模式ⅩⅧ、ⅩⅢ、ⅩⅩⅩⅧ、ⅩⅪ、Ⅱ、Ⅴ中模式ⅩⅧ、ⅩⅢ對(duì)應(yīng)的頭孢曲松MIC值相對(duì)較高，而模式Ⅱ的頭孢曲松MIC值相對(duì)較低，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［5，10，14］。值得注意的是模式ⅩⅩⅩⅧ為本次研究新發(fā)現(xiàn)，對(duì)應(yīng)的頭孢曲松MIC值也相對(duì)較高。

我們對(duì)PBP2相關(guān)突變位點(diǎn)（A501V、P551S、G542S及345）以及mtrR、porB、ponA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大部分頭孢曲松低敏淋球菌菌株的這些基因均存在與文獻(xiàn)報(bào)道一致的突變位點(diǎn)［5，14-16］，其中A501V位點(diǎn)的突變率隨著菌株MIC值的增加呈上升趨勢(shì)，在3株頭孢曲松MIC值為0.5 μg/ml的菌株中的突變率為100%，且在模式II中不存在。但是該突變位點(diǎn)以及其他的突變位點(diǎn)在兩組菌株中所占的比例，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因?yàn)檫@些突變位點(diǎn)同時(shí)也存在余本研究的高敏株中。我們推測(cè)原因可能有以下方面：①WHO西太平洋區(qū)耐藥監(jiān)測(cè)指南在CLSI標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性降低折點(diǎn)的判定，即將MIC為（0.06～0.50）μg/ml的淋球菌判定為頭孢曲松低敏菌株，目前本地區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)顯示大部分的菌株對(duì)頭孢曲松的MIC值都集中在0.06 μg/ml折點(diǎn)附近，這種菌株MIC值的非均勻分布，可能導(dǎo)致分析數(shù)據(jù)具有一定的偏倚；②mtrR基因編碼的是轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，其作用是使細(xì)菌外排能力增強(qiáng)，而porB基因編碼的是淋球菌的外膜孔蛋白，兩者均介導(dǎo)的是細(xì)菌的非特異性耐藥機(jī)制，因此，這兩個(gè)基因的突變可能不是導(dǎo)致淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性降低的關(guān)鍵因素；③本研究我們只對(duì)mtrR、porB、ponA三種基因的部分序列以及penA基因進(jìn)行了測(cè)序分析，可能存在其他位點(diǎn)的突變或其他不確定的耐藥基因參與了淋球菌對(duì)頭孢曲松的敏感性降低。

綜上所述，PBP2鑲嵌樣結(jié)構(gòu)并不是導(dǎo)致深圳地區(qū)淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性降低的主要原因，PBP2模式ⅩⅧ、ⅩⅢ、ⅩⅩⅩⅧ包含菌株對(duì)應(yīng)的頭孢曲松的MIC值較高，而模式Ⅱ的頭孢曲松MIC值相對(duì)較低，推測(cè)非鑲嵌樣PBP2 500～580位多個(gè)特定位點(diǎn)氨基酸突變的聯(lián)合作用可能與淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性的降低具有一定的相關(guān)性，還需要進(jìn)一步了解深圳地區(qū)淋病奈瑟菌對(duì)頭孢曲松敏感性降低的分子機(jī)制。

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Analysis of antibiotic resistance genes inNeisseria gonorrhoeaestrains with decreased sensitivity to ceftriaxone from Shenzhen city

Zhang Lijun,Wang Feng,Mo Junluan,Peng Yi.Clinical Laboratory for Pathogen Detection, Shenzhen Center for Chronic Disease Control,Shenzhen 518020,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Wang Feng,Email:biowangfeng@163.com

Wang Feng,Email:biowangfeng@163.com

ObjectiveTo analyze the relationship ofpenA,ponA,porBandmtrRgene mutations with the reduced sensitivity to ceftriaxone inN.gonorrhoeaeisolates from Shenzhen city.MethodsA total of 296 clinical isolates ofN.gonorrhoeaewere collected in Shenzhen city from 2009 to 2011.The agar dilution method was used to estimate the sensitivity of theseN.gonorrhoeaeto ceftriaxone.Totally,53 strains with reduced sensitivity to ceftriaxone（minimum inhibitory concentration（MIC）:0.06-0.50 μg/ml）were identified,and 53 strains with high sensitivity to ceftriaxone were randomlyselectedfromtheremainingstrainsandservedasthe controlgroup.PCRwasperformedto amplifythepenA,ponA,porBandmtrRgenes from the 106 isolates followed DNA sequencing.ResultsThe mosaic structure of the penicillinbindingprotein2（PBP2）gene（penAgene）wasfoundinonlyone isolate witha ceftriaxone MICof0.1250 μg/ml.Amino acid sequence analysis of the remaining 105 isolates yielded 16 different amino acid patterns.The MICs of ceftriaxone were relatively high（0.062 5 μg/ml）inN.gonorrhoeaestrains harboring the amino acid patternsⅩⅢ,ⅩⅧorⅩⅩⅩⅧ, but relatively low（0.008 0 μg/ml）in those harboring the amino acid patternⅡ.No significant differences were observed in the frequency ofmtrR,porBor ponA gene mutations betweenN.gonorrhoeaeisolates with reduced sensitivity to ceftriaxone and those with high sensitivity（all P＞0.05）.Conclusions The mosaic structure of PBP2 may be not the primary reason for reduced sensitivity ofNeisseria gonorrhoeaeto ceftriaxone in Shenzhen,while different amino acid patterns produced by various mutations in amino acid residues at positions 500-580 in the non-mosaic PBP2,together withmtrR,porBandponAmutations,may play more important roles in the reduced sensitivity.

Neisseria gonorrhoeae;Ceftriaxone;DNA mutational analysis;Microbial sensitivity tests;Drug resistance,microbial

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.006

深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目（201401071）

518020深圳市慢性病防治中心病原檢驗(yàn)科

王峰，Email：biowangfeng@163.com

2014-11-10）

（本文編輯：尚淑賢）