羅素菊 劉欣欣 鄭焱 許文娟 李燕 劉全忠

白細(xì)胞介素22對HaCaT細(xì)胞他扎羅汀誘導(dǎo)基因3表達(dá)的影響

羅素菊 劉欣欣 鄭焱 許文娟 李燕 劉全忠

目的 探討白細(xì)胞介素22（IL-22）對HaCaT細(xì)胞他扎羅汀誘導(dǎo)基因3（TIG3）表達(dá)的影響。方法用12.5～100 μg/L IL-22、IL-22+PD98059（MAPK-ERK1/2通路抑制劑）及IL-22+AG490（JAK2/STAT3通路抑制劑）干預(yù)處理HaCaT細(xì)胞24 h后，分別提取HaCaT細(xì)胞總蛋白及總RNA，用免疫熒光、Western印跡法、ELISA法檢測TIG3的蛋白水平，用實時熒光定量RT-PCR檢測TIG3 mRNA水平的改變。結(jié)果 免疫熒光檢測顯示，HaCaT細(xì)胞內(nèi)TIG3蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)。用Western印跡法檢測，用12.5、25、50、100 μg/L的IL-22干預(yù)處理后，HaCaT細(xì)胞中TIG3蛋白表達(dá)分別為0.743±0.035，0.678±0.040，0.582±0.041和0.328±0.032，均低于對照組0.839±0.045（P＜0.05）。酶聯(lián)免疫法檢測的結(jié)果示，上述濃度的IL-22干預(yù)處理后，TIG3蛋白水平變化的趨勢與Western印跡法的結(jié)果一致。定量RT-PCR檢測示TIG3 mRNA分別為對照組的0.838±0.036，0.686±0.061，0.565±0.047，0.457±0.033（P＜0.05）。加入信號通路抑制劑后，TIG3蛋白和mRNA水平降低程度較無抑制劑組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 IL-22可劑量依賴抑制HaCaT細(xì)胞TIG3的表達(dá)，其機(jī)制可能與MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3通路有關(guān)。

白細(xì)胞介素22；Janus激酶2；MAP激酶激酶1/2；他扎羅汀誘導(dǎo)基因3；HaCaT細(xì)胞；STAT3轉(zhuǎn)錄因子

白細(xì)胞介素22（IL-22）是Th17、Th22細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)。IL-22在銀屑病患者外周血及皮損中升高，其水平和銀屑病的嚴(yán)重程度相關(guān)［1］。他扎羅汀誘導(dǎo)基因3（tazarotene-induced gene 3，TIG3）是一種腫瘤抑制因子，在銀屑病，鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌中表達(dá)降低，提示在角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化過程中起重要作用［2］。我們推測，IL-22參與銀屑病的發(fā)病可能與IL-22調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞TIG3的表達(dá)有關(guān)。我們前期［3］研究表明，IL-22可以引起絲裂原活化蛋白激酶（MAPK-ERK1/2）和轉(zhuǎn)錄激活因子途徑（JAK/STAT）這兩條信號通路的激活。在本研究中，我們研究IL-22對HaCaT細(xì)胞TIG3表達(dá)的影響，在加入MAPKERK1/2和JAK/STAT信號通路抑制劑后，檢測HaCaT細(xì)胞TIG3表達(dá)的改變，以探討其可能的作用機(jī)制。

一、資料與方法

（一）資料：

1.實驗細(xì)胞：HaCaT細(xì)胞系德國柏林自由大學(xué)本杰明·富蘭克林醫(yī)學(xué)中心惠贈，在實驗室長期凍存。

2.主要試劑：重組人IL-22（美國ProteinSpecialists公司），TIG3（美國Santa Cruz公司），F(xiàn)ITC-鼠抗兔熒光二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），PD98059、AG490（美國Millipore公司），Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），TIG3蛋白ELISA試劑盒（美國RD公司），TIG3、β肌動蛋白的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3.主要儀器：酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Biotek公司），凝膠成像系統(tǒng)儀（英國Cambridge公司），實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），Nikon Eclip SE 80i型顯微鏡（日本Nikon公司），CO2孵育箱（美國Forma Scientific公司）。

（二）方法：

1.HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：細(xì)胞培養(yǎng)具體步驟參照文獻(xiàn)［3］，待細(xì)胞70%～80%融合時，分為 12.5、25、50、100 μg/L IL-22組，PD98059+50 μg/L IL-22組，AG490+ 50 μg/L IL-22組及對照組（用等量PBS干預(yù)處理），分別進(jìn)行干預(yù)處理，干預(yù)處理后繼續(xù)孵育24 h。在免疫熒光檢測中為排除蛋白的非特異著色選擇陰性對照組，陰性對照組用PBS代替一抗。

2.免疫熒光檢測TIG3蛋白：干預(yù)處理后的細(xì)胞爬片，冰丙酮固定，0.1% Txiton X 100處理后，用5%BSA封閉，TIG3抗體4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC-鼠抗兔熒光二抗，37℃孵育60 min，DAPI染核10 min，封片，熒光共聚焦顯微鏡觀察。

3.HaCaT細(xì)胞總蛋白提取及Western印跡：提取細(xì)胞總蛋白，測蛋白濃度后進(jìn)行Western印跡，具體步驟參照文獻(xiàn)［3］。一抗（TIG3）、二抗（HRP-抗兔二抗）及內(nèi)參照β肌動蛋白抗體孵育，ECL暗室曝光顯色。檢測各實驗組TIG3蛋白的表達(dá)。每組實驗重復(fù)3次。

4.ELISA法檢測TIG3蛋白的表達(dá)：將上述提取的蛋白樣品采用雙抗體夾心ELISA法，分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，空白孔，待測樣品孔。參照試劑盒使用說明書，用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的吸光度。每個樣本重復(fù)3次。制作樣品濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)其計算各樣品的濃度。應(yīng)用BCA法測樣品總蛋白濃度。統(tǒng)計不同樣品TIG3蛋白濃度與總蛋白濃度的比值。

5.細(xì)胞總RNA的提取及實時熒光定量RT-PCR：提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計測A260nm/A280nm吸光度檢測RNA的純度及濃度，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μl，按照試劑盒說明設(shè)定反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，具體參照文獻(xiàn)［3］。TIG3上游引物：5′-CAGTATTGTGA GCAGGAACTGTGA-3′，下游引物：5′-TTGGCCTTTTCCACCT GTTTAC-3′；β肌動蛋白上游引物：5′-CCTGGCACCCAGCAC AAT-3′，下游引物：5′-CTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。結(jié)果取平均值。

二、結(jié)果

1.細(xì)胞免疫熒光檢測TIG3蛋白：FITC-TIG3染色顯示，TIG3蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)（綠色熒光物），隨IL-22濃度的升高，F(xiàn)ITC-TIG3染色陽性的HaCaT細(xì)胞減少，加入MAPKERK1/2和JAK/STAT信號通路阻斷劑PD9805和AG490后，F(xiàn)ITC-TIG3染色陽性的HaCaT細(xì)胞較50 μg/L IL-22組明顯增多（圖1）。

圖1 不同濃度IL-22以及信號通路阻斷劑PD98059和AG490對HaCaT細(xì)胞 TIG3蛋白的影響（FITC×200，標(biāo)尺為100μm）TIG3蛋白位于HaCaT細(xì)胞胞質(zhì)（綠色熒光物），隨干預(yù)處理的IL-22濃度的升高，F(xiàn)ITC-TIG3染色陽性的HaCaT細(xì)胞減少，加入信號通路抑制劑PD98059（1F）或AG490（1G）后，F(xiàn)ITC-TIG3染色陽性的HaCaT細(xì)胞均較50 μg/L IL-22組（1D）明顯增多

2.Western印跡法檢測HaCaT細(xì)胞TIG3蛋白的變化：12.5、25、50、100 μg/L IL-22干預(yù)處理后，HaCaT細(xì)胞中TIG3蛋白逐漸降低，依次為（TIG3與β肌動蛋白灰度比值）0.743±0.035、0.678±0.040、0.582±0.041、0.328±0.032，均較對照組（0.839±0.045）降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝68.755，P＜0.05），見圖2A。50 μg/L IL-22+PD98059組（0.847± 0.019）和50 μg/L IL-22+AG490（0.900±0.034）組均較50 μg/L IL-22組（0.588±0.060）升高（圖2B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝35.645，P＜0.05）。

圖2 A IL-22對HaCaT細(xì)胞TIG3蛋白的影響 1：對照組；2：12.5 μg/L IL-22；3：25 μg/L IL-22；4：50 μg/L IL-22；5：100 μg/L IL-22 圖2B 信號通路阻斷結(jié)果 1：對照組；2：50 μg/L IL-22；3：50μg/L IL-22+PD98059；4：50 μg/L IL-22+AG490

3.ELISA法檢測HaCaT細(xì)胞TIG3蛋白的改變：在加入不同濃度IL-22處理后TIG3蛋白的濃度與總蛋白濃度的比值（10-6）較對照組減少（F＝49.135，P＜0.05）。PD98059及AG490與50 μg/L IL-22共同干預(yù)后，TIG3蛋白的減少程度均較無抑制劑組（50 μg/L IL-22組）下降（圖3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝33.974，P＜0.05）。

圖3 不同濃度IL-22以及信號通路阻斷劑PD9805和AG490對HaCaT細(xì)胞TIG3蛋白的影響 a：與對照組相比，P＜0.05；b：與50 μg/L IL-22組相比，P＜0.05

4.實時熒光定量RT-PCR檢測HaCaT細(xì)胞TIG3 mRNA水平的變化：在加入不同濃度的IL-22后，HaCaT細(xì)胞TIG3 mRNA的水平均較對照組降低，PD98059及AG490與IL-22組共同干預(yù)后TIG3 mRNA的減少程度較無抑制劑組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 不同處理組HaCaT細(xì)胞TIG3 mRNA水平的改變

三、討論

目前認(rèn)為銀屑病的發(fā)病機(jī)制主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)的以角質(zhì)形成細(xì)胞為靶點的免疫應(yīng)答反應(yīng)。IL-22及Th22細(xì)胞在銀屑病中存在異常的高表達(dá)，提示IL-22可能與銀屑病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［4］。在正常情況下，IL-22可增強(qiáng)表皮屏障功能，促進(jìn)組織修復(fù)和傷口愈合；然而在機(jī)體免疫反應(yīng)失調(diào)時IL-22會持續(xù)高水平表達(dá)，進(jìn)而引起銀屑病樣皮炎等皮膚病理改變［5］。在正常皮膚中，TIG3主要分布在基底層、毛囊和皮脂腺中，在銀屑病、基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌等表皮增生性疾病中表達(dá)下降甚至缺失，推測TIG3表達(dá)的減少與角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和分化密切相關(guān)［6-7］。這些結(jié)果提示，IL-22和TIG3表達(dá)的異常在銀屑病發(fā)病中發(fā)揮一定作用，但有關(guān)IL-22和TIG3二者之間的關(guān)系尚不清楚。本研究結(jié)果表明，12.5～100 μg/L濃度的IL-22干預(yù)處理后可降低HaCaT細(xì)胞TIG3蛋白和mRNA的水平。結(jié)合我們的前期［8］研究結(jié)果，IL-22可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡，推測IL-22參與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)可能與抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中TIG3的表達(dá)有關(guān)。

在關(guān)于卵巢癌研究中發(fā)現(xiàn)，TIG3高表達(dá)于正常卵巢細(xì)胞，而在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)降低；MEK-ERK信號通路的激活可引起TIG3表達(dá)水平的降低，提示TIG3的表達(dá)可能與MEK-ERK這一信號通路有關(guān)［9］。本研究結(jié)果表明，在加入MAPK-ERK1/2通路特異性抑制劑PD98059和JAK2/STAT3通路抑制劑AG490后TIG3蛋白和mRNA的水平均較未加抑制劑組降低程度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示IL-22抑制HaCaT細(xì)胞TIG3的表達(dá)可能和MAPK-ERK1/2和JAK2/ STAT3這兩條信號通路有關(guān)。

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Effects of interleukin-22 on the expression of tazarotene-induced gene 3 in HaCaT cells

Luo Suju*,Liu Xinxin, Zheng Yan,Xu Wenjuan,Li Yan,Liu Quanzhong.*Department of Dermatology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Luo Suju,Email:luosuju2005@163.com

Luo Suju,Email:luosuju2005@163.com

ObjectiveTo evaluate the effects of interleukin-22（IL-22）on the expression of tazarotene-induced gene 3（TIG3）in HaCaT cells.MethodsCultured HaCaT cells were randomly divided into several groups to be treated with different concentrations（12.5,25,50,100 μg/L）of IL-22 alone,or the combination of 50 μg/L IL-22 with the MAPK-ERK1/2 inhibitor PD98059 or the JAK/STAT inhibitor AG490 for 24 hours.Those HaCaT cells treated with phosphate buffered saline served as the control group.Subsequently,total proteins and mRNAs were extracted from the HaCaT cells.An immunofluorescence assay,Western blot and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）were performed to determine the protein expression level of TIG3,and real-time fluorescence-based quantitative PCR to quantify the mRNA expression of TIG3 in HaCaT cells.ResultsThe immunofluorescence assay showed that TIG3 protein was mainly expressed in the cytoplasm of HaCaT cells.As Western blot revealed,the protein expression level of TIG3 was 0.743±0.035,0.678±0.040,0.582±0.041 and 0.328±0.032 in HaCaT cells treated with IL-22 of 12.5,25, 50 and 100 μg/L,respectively,significantly lower than that in the control group（0.839±0.045,allP＜0.05）.ELISA also showed a decrease in the protein expression of TIG3 in IL-22-treated HaCaT cells,which was consistent with Western blot results.Further more,the mRNA expression level（2－△△Ct）of TIG3 was significantly weaker in HaCaT cells treated with IL-22 of 12.5,25,50 and 100 μg/L than in the control group（0.838±0.036,0.686±0.061,0.565±0.047 and 0.457±0.033 vs.1.000,allP＜0.05）.The decrease in TIG3 mRNA and protein expressions was significantly attenuated in HaCaT cells treated with the combination of 50 μg/L IL-22 with PD98059 or AG490 compared with those treated with 50 μg/L IL-22 alone.ConclusionIL-22 can dose-dependently inhibit the expression of TIG3 in HaCaT cells,likely through the MAPK-ERK1/2 and JAK2/STAT3 signaling pathways.

Interleukin-22;Janus kinase 2;MAP kinase kinase 1/2;Tazarotene-induced gene 3;HaCaT cells; STAT3 transcription factor

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.012

國家自然科學(xué)基金（81201231、81371732）

300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚科（羅素菊、劉欣欣、許文娟、李燕、劉全忠）；西安交通大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科（鄭焱）

羅素菊，Email：luosuju2005@163.com

2014-12-10）

（本文編輯：吳曉初）