錢秋芳 程茹虹 李明 郭一峰 余霞 張珍 余紅 祁懷山 姚志榮

上海某中學青少年特應性皮炎和魚鱗病FLG基因型的研究

錢秋芳 程茹虹 李明 郭一峰 余霞 張珍 余紅 祁懷山 姚志榮

目的 探討青少年FLG基因型、了解特應性疾病患病率、發(fā)展進程及其FLG基因的關(guān)系。方法上海某中學334例11～19歲青少年作為研究樣本，進行魚鱗病、特應性皮炎（AD）、哮喘、鼻炎等特應性疾病的臨床病史及體征觀察、記錄。285例進行了外周血采樣及FLG基因高頻突變篩查。5年后，進行樣本人群隨訪，觀察并記錄各特應性疾病的臨床癥狀及體征。結(jié)果 5年前，334例青少年中AD19例（5.69%），尋常性魚鱗病14例（4.19%），過敏性鼻炎36例（10.78%），哮喘4例（1.20%）。在完成FLG基因測序的285例樣本中，攜帶FLG基因高頻突變者24例（8.42%）。5年后完成隨訪265例，失訪69例（20.66%），AD、魚鱗病、過敏性鼻炎及哮喘的患病人數(shù)分別為13例（4.89%）、15例（5.64%）、27例（10.15%）、1例（0.38%），原19例AD中6例進入完全緩解期，13例SCORAD評分明顯下降，原36例過敏性鼻炎中9例癥狀消失。單純AD、單純魚鱗病、AD合并魚鱗病的FLG基因高頻突變率分別為10.0%、55.6%、40.0%，且患魚鱗病與FLG基因突變有關(guān)（P＜0.001）。結(jié)論 青少年中，F(xiàn)LG基因高頻突變率為8.42%。FLG基因是尋常性魚鱗病的半顯性遺傳因素，中間絲聚合蛋白的表達受多因素影響。

皮炎，特應性；尋常鱗癬；青少年；突變；基因，F(xiàn)LG

中間絲聚合蛋白是表皮終末分化的重要組成蛋白，主要存在于表皮顆粒層和透明層，參與組成皮膚表皮外層的角質(zhì)包膜，促進表皮分化，形成表皮角質(zhì)層獨特的屏障結(jié)構(gòu)，在維持皮膚的屏障功能中具有重要作用。中間絲聚合蛋白基因（filaggrin gene， FLG）是該蛋白的編碼基因，若發(fā)生基因突變會引起天然保濕因子減少或缺失、角質(zhì)層功能受損并引起相關(guān)皮膚病變。研究證實，F(xiàn)LG基因突變可導致尋常性魚鱗病，也是特應性皮炎（AD）的易感因素，與哮喘、過敏性鼻炎的發(fā)病有一定的相關(guān)性。但FLG在中國漢族正常人群中的基因型及其與表型的關(guān)系尚不明確。

對象與方法

一、對象

選取上海市崇明縣長興島某中學學生334例作為研究對象，且均簽署知情同意書。本次研究已通過上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院倫理委員會的批準。

AD診斷標準：按Williams等診斷標準［1］，必須具有皮膚瘙癢史，加如下3條或3條以上：①屈側(cè)皮膚受累史，包括肘窩、腘窩、踝前或圍繞頸1周；②個人哮喘或枯草熱史；③全身皮膚干燥史；④屈側(cè)有濕疹；⑤2歲前發(fā)病。魚鱗病診斷標準：皮膚呈魚鱗狀、毛周角化病和掌紋癥。哮喘由呼吸科醫(yī)師診斷，鼻炎患者由耳鼻咽喉科醫(yī)師診斷。

二、臨床調(diào)查

由經(jīng)過統(tǒng)一培訓的皮膚科醫(yī)師現(xiàn)場進行臨床癥狀（尋常性魚鱗病、AD、哮喘、鼻炎）分析、記錄，采用統(tǒng)一的調(diào)查問卷。2009年3月作首次調(diào)查，2014年3-4月通過該校原各班班主任老師協(xié)助通知2009年的研究對象，再次來母校面對面回訪（共5場次），隨訪上述癥狀和體征。不能出席者，兩名皮膚科專科醫(yī)師上門或預約門診面對面回訪。

三、實驗室檢查

皮膚科護士采集研究對象靜脈血2 ml，-20℃冰箱凍存，備用于基因型分型。實驗時，將保存于-20℃EDTA抗凝管內(nèi)的外周靜脈血常溫解凍，采用血液基因組DNA提取試劑盒，按步驟提取600 μl抗凝全血中的基因組DNA（DNA濃度＞50 μg/L）。采用重疊PCR技術(shù)對研究對象進行FLG基因高頻突變（3321delA和K4671X）的篩查。PCR引物和條件參見Sandilands等［2］的文獻，采用應用生物系統(tǒng)3730 DNA分析儀（美國ABI公司）對PCR產(chǎn)物進行測序。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié)果

一、臨床表現(xiàn)

1.入組對象首次調(diào)查的一般資料及臨床癥狀：共計334例入選，該中學學生包括初中和高職學生。其中男178例（53.3%）、女156例（46.7%）。年齡11～19（14.52±1.85）歲。臨床表現(xiàn)：AD 19例（5.69%）、過敏性鼻炎36例（10.78%）、哮喘4例（1.20%）、尋常性魚鱗病14例（4.19%）。其中19例AD中2例合并過敏性鼻炎，2例合并哮喘，5例合并尋常性魚鱗病。一級親屬AD 3例，過敏性鼻炎8例、哮喘5例、尋常性魚鱗病7例。二級親屬過敏性鼻炎3例，哮喘2例。三級親屬僅過敏性鼻炎2例。

2.入組對象5年后隨訪的臨床癥狀：共隨訪265例，男142例、女123例。失訪69例（20.66%），其中已遷至外地30例，無法聯(lián)系38例，因白血病已亡1例。隨訪的265例年齡16～24（20.01±1.84）歲。AD 13例（4.91%）、過敏性鼻炎27例（10.19%）、哮喘1例（0.38%）、尋常性魚鱗病15例（5.66%）。5年后，19例 AD中 6例進入完全緩解期，13例SCORAD評分明顯下降；36例過敏性鼻炎中9例癥狀消失。

二、基因型結(jié)果

在研究對象334例中，完成基因測定285例，其余48例無法獲取血樣。男156例、女129例，年齡16～24（19.54±1.81）歲。檢測3321基因位點，276例未攜帶高頻突變，9例為雜合高頻突變攜帶者，出現(xiàn)3321delA雜合突變（3.16%），未檢測出純合突變者。檢測K4671X突變位點，270例未攜帶高頻突變，15例為雜合突變攜帶者，出現(xiàn)K4671X雜合突變（5.26%），未檢測出純合突變。未檢測出3321delA與K4671X復合雜合突變。FLG基因高頻突變共24例，突變率為8.42%。

三、基因型與表型

已測基因285例中，AD、過敏性鼻炎、哮喘、尋常型魚鱗病中FLG高頻突變率分別為20.0%（3/ 15）、8.7%（2/23）、0%（0/4）和50.0%（7/14，包括合并AD）。單純AD 10例，其中1例出現(xiàn)K4671X突變，未檢測出3321delA突變，F(xiàn)LG基因高頻突變率為10.0%（1/10）；單純性尋常魚鱗病9例，其中3例出現(xiàn)3321delA突變，2例出現(xiàn)K4671X突變，F(xiàn)LG基因高頻突變率為55.6%（5/9）。AD合并魚鱗病5例，其中2例出現(xiàn)3321delA突變，未檢測出K4671X突變，F(xiàn)LG基因高頻突變率為40.0%（2/5）。

在334例中，完成基因測定285例，5年前隨訪的人中，突變者共24例，未突變者261例；5年后隨訪到236例，其中突變者19例（失訪5例），未突變者217例（失訪44例）。無論是首次調(diào)查還是5年后隨訪，患者患AD、過敏性鼻炎、哮喘均與FLG基因突變不相關(guān)（P＞0.05），患魚鱗病與FLG基因突變有關(guān)（P＜0.001），見表1。而患者家族患AD和魚鱗病與FLG基因突變相關(guān)（P＜0.05），患過敏性鼻炎和哮喘與FLG基因突變無關(guān)（均P＞0.05），見表2。同樣，患者與家族共患AD和魚鱗病與FLG基因突變相關(guān)（P＜0.05），患過敏性鼻炎與FLG基因突變無關(guān)（均P＞0.05），見表3。

表1 5年前后患者基因型與其臨床表現(xiàn)的相關(guān)性（陽性數(shù)/檢測數(shù)）

表2 5年前后患者基因型與其家族臨床表現(xiàn)的相關(guān)性（陽性數(shù)/檢測數(shù)）

表3 5年前后患者基因型與其和家族共患疾病的相關(guān)性（陽性數(shù)/檢測數(shù)）

討論

近年來，各地報道的AD及相關(guān)特應性疾病的患病率不一，可能與地區(qū)、人群、種族和經(jīng)濟發(fā)展水平本身或是調(diào)查方式、診斷標準等諸多因素相關(guān)。顧恒等［3］調(diào)查了1998年11-12月中國11個省市青少年AD總標化患病率為0.69%，2002年10-11月中國10個省市1～7歲兒童AD總標化患病率為3.07%［4］，說明AD患病率與年齡呈負相關(guān)。曾三武等［5］對2001年10月至2002年10月天津市城市和農(nóng)村0～6歲兒童進行調(diào)查，兒童AD患病率為2.9%，城市為3.5%，農(nóng)村為2.4%，兒童AD患病率城市高于農(nóng)村。在日本，2001—2002年小學兒童AD患病率為11.2%［6］，而在非洲依索比亞的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)AD患病率為1.2%，城市為1.5%；農(nóng)村為0.3%［7］。中國臺灣一項調(diào)查顯示，2000—2007年間總?cè)丝贏D、過敏性鼻炎和哮喘患病率分別為6.7%、26.3%、11.9%，其中＜20歲AD占AD患病率的9.6%，同時患有AD和過敏性鼻炎者有更高的患哮喘風險［8］。

我們在上海某中學青少年334例2009—2014年間的隨訪研究中，2009年AD、過敏性鼻炎、哮喘、尋常性魚鱗病的患病比例分別為5.69%、10.78%、1.20%、4.19%；2014年AD、過敏性鼻炎、哮喘、魚鱗病的患病比例分別為4.89%、10.15%、0.38%、5.64%。上海2012年的一項調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，3～6歲兒童AD的患病率為8.3%，城市地區(qū)患病率比農(nóng)村地區(qū)顯著升高，患病率最高的在城區(qū)（徐匯區(qū)10.2%），而遠離城市的崇明縣（4.6%）最低［9］。有研究指出，生活在城市或家庭用聚氯乙烯地板的兒童AD患病率較高［10-12］。我們的研究對象為上海郊區(qū)青少年，AD患病率較低，或許也是因為環(huán)境因素的影響。

人類FLG基因定位于染色體1q21.3，為表皮分化復合物基因簇的成員之一，與表皮的終末分化形成皮膚屏障有關(guān)。FLG是尋常性魚鱗病的致病基因，也是特應性疾病的易感基因。FLG基因編碼（前）中間絲相關(guān)蛋白，前中間絲相關(guān)蛋白可降解成中間絲相關(guān)蛋白單體，這些蛋白質(zhì)在表皮終末分化和形成皮膚屏障中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明，AD與食物過敏、哮喘和過敏性鼻炎等也有強相關(guān)性（稱之為特應性進行曲）［13］。在完成FLG基因測序的285例樣本中，攜帶高頻FLG基因突變者24例（FLG突變率為8.42%），其中AD、過敏性鼻炎、哮喘、尋常性魚鱗病中FLG突變率分別為20.0%、8.7%、0%、50.0%。這一結(jié)果可能由于本次研究的樣本量過少所致，但我們?nèi)园l(fā)現(xiàn)AD中FLG突變率為20%，比其他特應性疾病的FLG突變率高。歐洲AD兒童R501X和2282del4突變的研究表明，AD兒童FLG突變率為26.7%，健康兒童的突變率為14.4%［14］，而且和并發(fā)哮喘有關(guān)［15］。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，單純AD、單純尋常性魚鱗病、AD合并尋常性魚鱗病的FLG基因高頻突變率分別為10.0%、55.6%、40.0%，此結(jié)果與課題組前期研究［16］一致，即發(fā)現(xiàn)中國漢族人群中，F(xiàn)LG突變率在尋常性魚鱗病中比在AD相關(guān)的尋常性魚鱗病中明顯升高，進一步說明在AD相關(guān)的尋常性魚鱗病中除了FLG基因突變，還有其他因素可導致前中間絲聚合蛋白和/或中間絲聚合蛋白表達下調(diào)，推測FLG基因僅是尋常性魚鱗病的半顯性遺傳因素。在5年后隨訪的19例AD患者中，除了4例未進行基因測序，其余15例患者中3例攜帶FLG基因突變（2例3321delA突變、1例K4671X突變）。此3例AD患者的SCORED評分平均值在5年前、后均比另12例未攜帶FLG高頻基因突變的AD患者高，而在未攜帶FLG基因高頻突變的AD患者中，5例在5年后的隨訪中癥狀已完全好轉(zhuǎn)。提示攜帶FLG基因突變的AD患者病情較重，病程持續(xù)時間較長，但樣本量太小，尚待進一步證實。

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Prevalence of atopic dermatitis,ichthyosis and filaggrin mutations in adolescents in a middle school in Shanghai

Qian Qiufang,Cheng Ruhong,Li Ming,Guo Yifeng,Yu Xia,Zhang Zhen,Yu Hong,Qi Huaishan,Yao Zhirong*.*Department of Dermatology,Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092,China
Corresponding author:Yao Zhirong,Email:dermatology.yao@sohu.com

ObjectiveTo investigate the prevalence and progression process of atopic diseases in adolescents, and to assess their relationship with filaggrin（FLG）mutations.MethodsTotally,334 adolescents aged from 11 to 19 years in a middle school in shanghai were enrolled into this study.A clinical interview was carried out to determine the prevalence of atopic diseases（such as ichthyosis,atopic dermatitis（AD）,asthma,rhinitis,etc）in these subjects. Peripheral blood samples were collected from 285 out of the 334 adolescents for screening for common FLG mutations, including 3321delA and K4671X.Five years later,these adolescents were followed up for reevaluation of clinical presentations of atopic diseases.Statistical analysis was carried out by the chi-square test with the SPSS 20.0 software.ResultsAs the baseline survey showed,19（5.69%）of the 334 adolescents had AD,14（4.19%）had ichthyosis vulgaris,36（10.78%）had allergic rhinitis,and 4（1.20%）had asthma.FLG mutations were observed in 24（8.42%）of the 285 adolescents.Five years later,265 adoscents completed the follow-up,and 69（20.66%）were lost to followup.Of the 265 adolescents reevaluated,13（4.89%）had AD,15（5.64%）had ichthyosis vulgaris,27（10.15%）had allergic rhinitis,and 1（0.38%）had asthma.By the time the second survey was performed,6 out of the 19 patients initially diagnosed with AD had achieved complete regression,13 had experienced a marked decrease in SCORing atopic dermatitis（SCORAD）score,and symptoms had disappeared in 9 of the 36 patients initially diagnosed with allergic rhinitis.The frequency of FLG mutations was 10.0%in patients with AD,55.6%in those with ichthyosis,and 40.0%in those with both AD and ichthyosis,and the development of ichthyosis was associated with FLG mutations（P＜0.001）.ConclusionsThe frequency of common FLG mutations was 8.42%in these adolescents.FLG gene may be a semidominant gene associated with ichthyosis vulgaris,and multiple factors influence its expression.

Dermatitis,atopic;Ichthyosis vulgaris;Adolescent;Mutation;Genes,filaggrin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.009

中華醫(yī)學會-歐萊雅中國人健康皮膚/毛發(fā)研究項目（S2013101009、S2014111103）

200092上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院皮膚科［錢秋芳（現(xiàn)在上海交通大學附屬兒童醫(yī)院皮膚科，200040）、程茹虹、李明、郭一峰、余霞、張珍、余紅、祁懷山、姚志榮］

姚志榮，Email：dermatology.yao@sohu.com

2015-04-28）

（本文編輯：吳曉初）