馬欣欣 張孟麗 李玲君 曹玉萍 吳秋菊 馬鵬程

腺病毒介導(dǎo)IL-24基因誘導(dǎo)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞COLO 16的凋亡

馬欣欣 張孟麗 李玲君 曹玉萍 吳秋菊 馬鵬程

目的 探討腺病毒介導(dǎo)IL-24基因表達(dá)載體（Ad-IL-24）對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌）細(xì)胞COLO 16的凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 將構(gòu)建的Ad-IL-24腺病毒感染COLO 16細(xì)胞，qPCR法檢測(cè)IL-24基因的表達(dá)，MTT法檢測(cè)IL-24過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-24過(guò)表達(dá)對(duì)COLO 16細(xì)胞凋亡的影響，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察在IL-24過(guò)表達(dá)后COLO 16細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化，Western印跡檢測(cè)Bax，Bcl-2以及活化的caspase 3蛋白水平，qPCR法檢測(cè)Bax、Bcl-2基因mRNA的表達(dá)，免疫熒光方法，檢測(cè)IL-24過(guò)表達(dá)后Bax，Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，Ad-IL-24組的細(xì)胞從第4天開始出現(xiàn)明顯抑制，第6天差異最明顯（P＜0.05），并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，而Ad-GFP組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。流式細(xì)胞儀顯示，Ad-IL-24組的COLO 16細(xì)胞凋亡率（13.10±0.92）%，顯著高于對(duì)照組（3.69±0.36）%（P＜0.05）和空載體組（3.39±1.06）%（P＜0.05），后兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。激光掃描共聚焦顯微鏡顯示，Ad-IL-24組細(xì)胞加速凋亡。免疫熒光、Western印跡法和QPCR法結(jié)果顯示，IL-24過(guò)表達(dá)后Bax在細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，而Bcl-2在細(xì)胞中的表達(dá)卻明顯下降。Western印跡法和qPCR法顯示，Ad-IL-24組的Bax、Bcl-2的蛋白及mRNA水平分別與對(duì)照組和空載組比較，出現(xiàn)了明顯的上升和下降，在蛋白水平上產(chǎn)生與抗cleaved caspase 3抗體結(jié)合的特異性條帶。結(jié)論 Ad-IL-24可誘導(dǎo)鱗癌細(xì)胞COLO 16細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax基因、下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，并活化caspase 3有關(guān)。

腫瘤，鱗狀細(xì)胞；白細(xì)胞介素24；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；COLO-16

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱鱗癌）是起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的一種惡性腫瘤，發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)為2%～3%，是最常見(jiàn)的非黑素瘤皮膚癌。關(guān)于鱗癌的發(fā)病機(jī)制普遍認(rèn)為與紫外線及化學(xué)藥物等有關(guān)，但關(guān)于其發(fā)病的分子機(jī)制尚不清楚［1］。IL-24又稱黑素分化相關(guān)基因7（MDA-7），主要由黑素瘤細(xì)胞和巨核細(xì)胞產(chǎn)生，是Jiang等［2］于1995年發(fā)現(xiàn)，由于其染色體定位在IL-10家族的基因族［3］；IL-24具有抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤新血管形成并誘導(dǎo)凋亡功能［4-7］，但不會(huì)影響正常細(xì)胞［4］。本實(shí)驗(yàn)用腺病毒介導(dǎo)IL-24基因表達(dá)載體，研究其對(duì)人鱗癌細(xì)胞COLO 16的生長(zhǎng)抑制和致凋亡作用，并探討Ad-IL-24對(duì)鱗癌作用的分子機(jī)制，為鱗癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資料與方法

一、資料

人鱗癌細(xì)胞COLO 16為本實(shí)驗(yàn)室保存。由漢恒生物科技（上海）有限公司提供攜帶白介素24（IL-24）的腺病毒表達(dá)載體（Ad-IL-24）、以及腺病毒Ad-GFP體（Ad-GFP）。噻唑藍(lán)（MTT）［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］。引物設(shè)計(jì)及合成［英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司］（表1）。FastStart Universal SYBRGreenMaster（美國(guó)Roche公司），碘化丙錠（PI）染色試劑盒（美國(guó)Southern Biothech公司），F(xiàn)ITC-annexinV染色試劑盒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司），AlexaFluor594熒光染料（美國(guó)Lifetechnologies公司），cleavedcaspase3一抗（美國(guó)CellSignalling公司，Bcl-2和Bax一抗（美國(guó)Abcam公司）。

表1 PCR引物序列

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)以及腺病毒感染：COLO 16細(xì)胞的培養(yǎng)基為含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，細(xì)胞置于含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、相對(duì)飽和濕度95%條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分3組：①Ad-IL-24組：將細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到50%時(shí)，換液，再加入攜帶IL-24的腺病毒表達(dá)載體Ad-IL-24后培養(yǎng)2 h，換液后供使用；②Ad-GFP組：將細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到50%時(shí)，細(xì)胞換液，再加入腺病毒Ad-GFP體Ad-GFP后培養(yǎng)2 h，換液后供本實(shí)驗(yàn)使用；③空白組：未做任何處理的COLO 16細(xì)胞。參照漢恒生物公司腺病毒感染手冊(cè)，貼壁細(xì)胞加入的病毒范圍在MOI=20～ 50內(nèi)，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，本實(shí)驗(yàn)每組均加入病毒量為MOI=40。

2.qPCR法檢測(cè)：上述3組細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。收集感染72 h后的COLO 16細(xì)胞，PBS洗滌3次，按RNA抽提試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，吸去培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞1次，加入RNAiso Plus裂解細(xì)胞，并按照提取步驟提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，步驟參照FastStart Universal SYBR Green Master說(shuō)明書。

3.MTT法檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COLO 16細(xì)胞按1×104/孔的密度接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分組及處理方法同上。分別于0、1～6 d加MTT每孔10 μl，繼續(xù)孵育4 h后加入溶解劑DMSO 150 μl，在微量振蕩儀上適度振蕩8 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分組及處理方法同2。培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞懸液，PB洗滌3次，70%冷乙醇固定后，加入PI等試劑，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化。

5.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察：實(shí)驗(yàn)分組及處理方法同2。PI染色：培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞懸液，PBS洗滌3次，4%甲醛固定，按照FITC-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作，每孔加入binding buffer 100 μl和Annexin V 2 μl，室溫下孵育10 min。DAPI染色：細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，將一定濃度的DAPI加入培養(yǎng)基中與細(xì)胞共同孵育過(guò)夜，再用PBS緩沖液漂洗6次。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變以檢測(cè)細(xì)胞的早期和晚期凋亡。

6.Western印跡檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分組及處理方法同2。培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液進(jìn)行充分裂解，離心，取總蛋白上清，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；加入兔抗人Bax、Bcl-2、cleaved caspase 3，37℃孵育1 h，TBST洗滌；再加山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h，TBST洗滌后將NC膜與發(fā)光工作液充分接觸，室溫孵育3 rain，暗室進(jìn)行壓片、曝光、顯影和定影。

7.qPCR法檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分組及處理方法同2。培養(yǎng)72 h后，按試劑盒說(shuō)明步驟抽提細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，具體步驟參照FastStart Universal SYBR Green Master試劑說(shuō)明書。

8.免疫熒光方法檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分組及處理方法同2。培養(yǎng)72 h后，PBS洗滌3次，4%甲醛固定10 min，透化液處理30 min，加入兔抗人Bax、Bcl-2，4℃孵育過(guò)夜，CONTROL洗滌；再加山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，封片，留待鏡下觀察。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、IL-24腺病毒轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

將Ad-IL-24、Ad-GFP感染COLO 16細(xì)胞，72 h收細(xì)胞進(jìn)行定量PCR試驗(yàn)，檢測(cè)病毒效價(jià)（圖1）。感染了Ad-IL-24的細(xì)胞中，IL-24基因的表達(dá)較感染Ad-GFP以及空白組有明顯上升（P＜0.05）。

圖1 各組COLO 16細(xì)胞中IL-24基因的表達(dá)情況 a：與空白組比較，P＞0.05；b：與空白組比較，P＜0.05

二、Ad-IL-24對(duì)COLO 16細(xì)胞增殖的影響

圖2 可見(jiàn)，第1～3天，3個(gè)組間的細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第4天開始，Ad-IL-24組的細(xì)胞增殖顯著低于Ad-GFP組和空白組（P＜0.05），第6天差異最大，并在4 d后Ad-GFP組細(xì)胞呈現(xiàn)時(shí)間依賴性抑制；而Ad-GFP組與空白組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 MTT法檢測(cè)Ad-IL-24對(duì)COLO 16細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制 第1～3天，3個(gè)組間的細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第4天開始，Ad-IL-24組的細(xì)胞增殖顯著低于Ad-GFP組和空白組（P＜0.05），第6天差異最大，并在4 d后Ad-GFP組細(xì)胞呈現(xiàn)時(shí)間依賴性抑制；而Ad-GFP組與空白組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

三、Ad-IL-24對(duì)COLO 16細(xì)胞的凋亡的影響

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)（圖3）發(fā)現(xiàn)，Ad-IL-24組COLO 16細(xì)胞凋亡率（13.10±0.92）%，顯著高于空白組凋亡率（3.69±0.36）%（P＜0.05）和Ad-GFP組凋亡率（3.39±1.06）%（P＜0.05），而空白組與Ad-GFP組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。圖3顯示，Ad-IL-24組的細(xì)胞早期凋亡（右下方）與空白組和Ad-GFP組有一定差異，而晚期凋亡（右上方）更明顯。

圖3 Ad-IL-24對(duì)COLO 16細(xì)胞凋亡的影響 Ad-IL-24組細(xì)胞凋亡率（13.1±0.92）%，顯著高于空白組凋亡率（3.69±O.36）%（P＜0.05）和Ad-GFP組凋亡率（3.39±1.06）%（P＜0.05），Ad-IL-24組的細(xì)胞早期凋亡（右下方）與空白組和Ad-GFP組有一定差異，而晚期凋亡（右上方）更明顯

四、Ad-IL-24病毒感染人鱗癌細(xì)胞COLO 16后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

感染Ad-IL-24病毒的COLO 16細(xì)胞，72 h后可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性（圖4A），細(xì)胞變圓，聚集成團(tuán)，部分細(xì)胞漂浮，數(shù)量明顯減少，Ad-GFP組和空白組COLO 16細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)良好，形態(tài)完整。分別對(duì)空白組、Ad-GFP組、Ad-IL-24組COLO 16細(xì)胞行DAPI染色及PI染色后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到 Ad-IL-24組COLO 16細(xì)胞有明顯的早期凋亡信號(hào)（圖4B）并出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小、核濃縮、邊集、碎裂并形成凋亡小體（圖4C），而空白組和Ad-GFP處理的COLO 16細(xì)胞的細(xì)胞核均呈彌散均勻的熒光。

圖4 Ad-IL-24感染后COLO 16細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（×400） 4A：未做任何處理的細(xì)胞組普通顯微鏡觀察；4B：PI染色，Ad-IL-24組細(xì)胞熒光染色明顯，說(shuō)明有明顯的早期凋亡信號(hào)；4C：DAPI染色，通過(guò)藍(lán)色熒光可見(jiàn)Ad-IL-24組細(xì)胞體積縮小、核濃縮、邊集、碎裂并形成凋亡小體

五、Ad-IL-24對(duì)人COLO 16細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響

免疫熒光結(jié)果（圖5）顯示，IL-24過(guò)表達(dá)后Bax在細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加，而Bcl-2在細(xì)胞中的表達(dá)卻明顯減少。Western印跡（圖6）結(jié)果顯示，Ad-IL-24組Bax、Bcl-2的蛋白水平分別相對(duì)于空白組和Ad-GFP組出現(xiàn)了明顯的上升和下降。Ad-IL-24組產(chǎn)生了相對(duì)分子質(zhì)量為17 000和19 000并能與抗活化的caspase 3抗體結(jié)合的特異性條帶，而空白組和Ad-GFP組則在相應(yīng)位置均未出現(xiàn)上述條帶。

圖5 免疫熒光（×200） 熒光明顯為表達(dá)升高，可見(jiàn)Ad-IL-24組中，Bax在細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，Bcl-2在細(xì)胞中的表達(dá)明顯下降

圖6 COLO 16細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白和活化caspase 3的蛋白表達(dá)水平 1：空白組；2：Ad-GFP組；3：Ad-IL-24組；Ad-IL-24組產(chǎn)生了相對(duì)分子質(zhì)量為17 000和19 000并能與抗cleaved caspase 3抗體結(jié)合的特異性條帶，而空白組和Ad-GFP組則在相應(yīng)位置均未出現(xiàn)上述條帶

討論

IL-24基因是一個(gè)既能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)期的凋亡、調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化，又能抑制血管生成，刺激免疫細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的抑癌基因［8-9］，還能增強(qiáng)放療敏感性和免疫調(diào)節(jié)作用［10］，而對(duì)正常細(xì)胞和組織無(wú)毒副作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，IL-24基因可以明顯抑制胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但對(duì)鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以人鱗癌皮損培養(yǎng)獲得的皮膚鱗癌細(xì)胞COLO 16［11］為模型，將腺病毒載體介導(dǎo)的Ad-IL-24感染該細(xì)胞后，IL-24蛋白在COLO 16細(xì)胞內(nèi)可高表達(dá)，感染4 d后能明顯抑制細(xì)胞增殖且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性抑制。同時(shí)，IL-24能明顯誘導(dǎo)COLO 16細(xì)胞凋亡，在激光共聚焦顯微鏡下也能觀察到明顯的早期凋亡信號(hào)和凋亡小體。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，Ad-IL-24組的COLO 16細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組和Ad-GFP組（P＜0．05），而圖3顯示Ad-IL-24組的細(xì)胞晚期凋亡比早期凋亡更明顯，說(shuō)明IL-24主要誘導(dǎo)COLO 16細(xì)胞的晚期凋亡。

Bcl-2是抗細(xì)胞凋亡家族中的基本成員，與其相關(guān)的Bax則具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，兩者形成Bax/Bcl-2異源二聚體，一般認(rèn)為Bax/Bcl-2的比值決定細(xì)胞是否凋亡［12］。Bax的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放，或直接與凋亡蛋白酶激活因子、caspase 9結(jié)合成3元復(fù)合物，并激活后者，激活的 caspase 9進(jìn)一步酶切并活化 caspase 3，而caspase 3是一種促凋亡因子，caspase級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一［13-14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ad-IL-24可以使COLO 16細(xì)胞中的Bax基因的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，而使Bcl-2基因的蛋白和mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，Bax/Bcl-2比值顯著增高；并且感染Ad-IL-24的COLO 16細(xì)胞中出現(xiàn)了活化的cleaved caspase 3特異性條帶。結(jié)果提示，Ad-IL-24感染導(dǎo)致COLO 16細(xì)胞凋亡，與提高Bax/Bcl-2比值、激活easpase-3等級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制有關(guān)。

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Adenovirus-mediated IL-24 gene expression induces apoptosis in a human squamous cell carcinoma cell line COLO 16

Ma Xinxin,Zhang Mengli,Li Lingjun,Cao Yuping,Wu Qiuju,Ma Pengcheng.Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Ma Pengcheng,Email:mpc815@163.com

Ma Pengcheng,Email:mpc815@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of adenovirus-mediated IL-24（Ad-IL-24）gene expression on the apoptosis in a human squamous cell carcinoma cell line COLO 16,and to explore the underlying molecular mechanism.MethodsCultured COLO 16 cells were divided into two groups to be transfected with an adenovirus vector carrying the IL-24 gene（Ad-IL-24 group）or green fluorescent protein（Ad-GFP group）,while those receiving no treatment served as the control group.After culture for different durations,qPCR was performed to quantify IL-24 gene expression,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay to evaluate the proliferative activity of COLO 16 cells,flow cytometry to detect the apoptosis of COLO 16 cells,laser scanning confocal microscopy（LSCM）to observe the morphological changes of COLO 16 cells,Western blot to determine the levels of Bax and Bcl-2 proteins and to evaluate the activation of caspase-3,qPCR to determine the levels of Bax and Bcl-2 mRNAs,an immunofluorescence assay to observe the expression of Bax and Bcl-2 proteins.Statistical analysis was carried out by a two-samplet-test with the SPSS 19.0 software.ResultsMTT assay showed that the proliferation of COLO 16 cells in the Ad-IL-24 group was significantly inhibited as early as 4 days after the transfection;thereafter,the inhibitory effect increased in a timedependent manner,and peaked on day 6（P＜0.05）.However,there was no significant difference in cellular proliferative activity between the Ad-GFP group and control group（P＞0.05）.Flow cytometry revealed that the apoptosis rate was significantly higher in the Ad-IL-24 group（13.10%±0.92%）than in the control group（3.69%±0.36%,P＜0.05）and Ad-GFP group（3.39%±1.06%,P＜0.05）,but no significant difference was observed between the control group and Ad-GFP group（P＞0.05）.LSCM demonstrated that the apoptosis of COLO 16 cells was accelerated in the Ad-IL-24 group. The immunofluorescence assay,Western blot and qPCR all showed that the mRNA and protein expressions of Bax were increased,but those of Bcl-2 were decreased in the Ad-IL-24 group compared with the Ad-GFP group and control group. Moreover,Western blot showed a protein band that could specifically bind to the anti-cleaved caspase-3 antibody in the Ad-IL-24 group,but not in the Ad-GFP group or control group.ConclusionsAd-IL-24 can induce apoptosis in humanCOLO 16 squamous cell carcinoma cells,probably by up-regulating Bax expression,down-regulating Bcl-2 expression,and activating caspase 3.

Neoplasms,squamous cell;Interleukin-24;Apoptosis;Caspase 3;COLO 16 cell

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.004

江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)（BL2012003）

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所

馬鵬程，Email：mpc815@163.com

2015-04-29）

（本文編輯：吳曉初）