李喜鳳，安碩，張偉曉，王優(yōu)湑，賈永艷

(河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州 450046)

桔梗為桔?？浦参锝酃Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.]的干燥根[1]，是我國銷量最大的 40 種傳統(tǒng)中藥材之一。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，桔梗性平，味苦、辛，具有化痰止咳、利咽開音、宣暢肺氣、排膿消癰的功效[2]。桔梗的主要活性成分為桔梗皂苷[3]，具有抗低溫、抗高溫、抗毒、抗應(yīng)激、抗放射、抗肥胖、抗腫瘤、抗水腫及利尿作用等，對(duì)增強(qiáng)細(xì)胞免疫和提高特異性抗體生成有一定作用，并對(duì)急性及慢性炎癥也有較強(qiáng)的抗炎作用。為了更好的開發(fā)利用桔梗皂苷，筆者本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[4-5]和星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法[6-8]，優(yōu)化桔梗總皂苷的提取工藝，并比較兩種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為充分利用桔梗藥材資源提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2000型紫外分光光度儀(上海尤尼柯儀器有限公司)，YUEPINGFA2004b型電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司，感量:0.01 mg)，KQ-100E型數(shù)控超聲清洗器(鞏義市英峪予華儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.2 試藥 桔梗飲片(湖北金貴中藥飲片有限公司，批號(hào):131101);桔梗皂苷D(成都曼斯特生物科技有限公司，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，含量＞99.6%，批號(hào):MUST-12082211);香草醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20120911);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 桔梗總皂苷含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液制備 取桔梗藥材15 g，按各實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件進(jìn)行提取，合并提取液定容至250mL量瓶中。精密吸取5mL(相當(dāng)于藥材量0.3 g)，水浴揮干，純化水溶解揮干所得物至20mL試管中，用水飽和的正丁醇萃取(4×20mL)，合并萃取液，回收正丁醇至干，殘?jiān)眉状既芙廪D(zhuǎn)移至10mL量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桔梗皂苷D對(duì)照品3.87 mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.1.3 最大吸收波長的確定 精密移取對(duì)照品溶液0.4mL及供試品溶液0.2mL，于70℃水浴蒸發(fā)至干，加入 5%香草醛-冰醋酸 0.2mL，高氯酸 0.8mL，于60℃水浴保溫顯色15 min，冰水浴中冷卻5 min。加冰醋酸5mL，搖勻，立即在分光光度計(jì)波長400～800nm下掃描，同時(shí)空白溶液作參比。對(duì)照品及供試品的最大吸收波長均在478nm，故以478nm為測(cè)定波長。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL，置具塞試管中，于70 ℃水浴揮干，按測(cè)定方法同法處理，測(cè)定吸收值并回歸。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 A=1.49X+0.037，R2=0.9990。結(jié)果表明桔梗皂苷D 在0.03854～0.30836 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 用同一對(duì)照品溶液，依“2.1.3”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，結(jié)果RSD為0.24%，說明儀器的測(cè)試性能良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于0，10，20，30，40，50，60 min 進(jìn)行測(cè)定，吸光度的RSD=0.26%，結(jié)果表明供試品溶液在60 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照供試品溶液制備項(xiàng)下方法平行6份制備，分別測(cè)定各樣品吸光度RSD=1.17%。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精確吸取9份已知含量的桔梗供試品溶液各1mL，分別精密加入桔梗皂苷D對(duì)照品適量，依“2.1.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)方法顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。平均加樣回收率為 99.71%，RSD為 1.72%(n=9)。

2.2 浸膏得率測(cè)定方法 精密吸取樣品液50mL，置已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，105℃真空干燥，至恒質(zhì)量后于干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質(zhì)量，計(jì)算，即得。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度考察 準(zhǔn)確稱取桔梗藥材6份，每份15 g，分別加 10倍量 50%，60%，70%，80%，90%乙醇回流提取2 h，濾過，濾液減壓濃縮，定容至100mL量瓶中，測(cè)定桔?？傇碥盏奈舛戎?，吸光度在乙醇濃度為70%時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%以后，吸光度值開始下降，所以選擇乙醇濃度70%為最佳。結(jié)果見圖1。

表1 桔梗皂苷D加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery test on kikyosaponin D

圖1 不同乙醇濃度對(duì)桔梗提取工藝的影響Fig.1 Effects of different concentration of ethanol on the extraction process of Platycodon grandiflorum

2.3.2 溶劑倍量考察 準(zhǔn)確稱取桔梗藥材5份，每份15 g，分別加 4，6，8，10，12 倍量 70%乙醇提取 2 h，濾過，濾液減壓濃縮定溶至100mL量瓶中，測(cè)定桔?？傇碥盏奈舛戎?，結(jié)果見圖2。

2.3.3 提取時(shí)間考察 準(zhǔn)確稱取桔梗藥材6份，每份15 g，加 10 倍量 70%乙醇，分別于30，60，90，120，150，180 min提取1次，濾過，濾液減壓濃縮，定容至100mL量瓶中，測(cè)定桔梗總皂苷的吸光度值，結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)桔梗提取工藝的影響Fig.3 Effects of different time of distillation on the extraction process of Platycodon grandiflorum

2.3.4 提取次數(shù)考察 準(zhǔn)確稱取桔梗藥材15 g，加10倍量70%乙醇，提取3次，每次2 h，桔?？傇碥盏?次提取量占總量的絕大部分，前2次提取量占總提取量的比例為89.73%。故選擇提取2次。

2.4 桔?；亓魈崛」に噧?yōu)化

2.4.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 桔梗皂苷類成分可溶于水、甲醇，易溶于乙醇，本實(shí)驗(yàn)采用乙醇回流法進(jìn)行提取，根據(jù)單因素結(jié)果，選用乙醇濃度、溶劑倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)，以桔?？傇碥盏暮繛橹骱透筛嗟寐蕿檩o來評(píng)價(jià)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2～5。

表2 L9(34)實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.2 Factors and levels of L9(34)experiment

結(jié)果分析如下。①直觀分析:根據(jù)極差R的大小，所考察4個(gè)因素對(duì)桔?？傇碥蘸康挠绊?，顯著性大小為C＞D＞A＞B，即提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞乙醇濃度＞溶劑用量。對(duì)干膏得率的影響，顯著性大小為A＞D＞B＞C，即乙醇濃度＞提取次數(shù)＞溶劑用量＞提取時(shí)間。②方差分析:對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表4和表5。分析結(jié)果表明，提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)桔?？傇碥帐章视酗@著影響，乙醇濃度對(duì)干膏得率具有顯著性影響。綜合直觀分析及工業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際情況，因此確定桔梗總皂苷的最佳提取工藝為6倍量70%的乙醇回流提取2次，每次180 min。

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表和結(jié)果Tab.3 L9(34)orthogonal experiment table and results

表4 桔?？傇碥蘸糠讲罘治鯰ab.4 Variance analysis of the content of total saponins from Platycodon grandiflorum

表5 干膏得率方差分析Tab.5 Variance analysis on the yield of dry extract

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):在確定優(yōu)化工藝后，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表6。

由表6可以看出，該提取工藝穩(wěn)定、可靠，達(dá)到提取優(yōu)化的目的。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of verification test

2.4.2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度(50%～90%)、溶劑倍量(6～12倍)、提取時(shí)間(30～200 min)為考察因素，由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，將提取數(shù)定為2次。按星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法三因素五水平表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平見表7，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表8。

表7 因素水平表Tab.7 Factors and levels

以總皂苷含量和干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化的用Hassan分別轉(zhuǎn)化為0～1的總評(píng)“歸一值(OD)”，按 OD=(d1×d2…dn)1/n(n 為指標(biāo)數(shù))計(jì)算，對(duì)取值越小越好的響應(yīng)和取值越大越好的響應(yīng)進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求歸一值 dmin和 dmax，dmin=(Ymax－Yi)/(Ymax－Ymin)，dmax=(Yi－Ymin)/(Ymax－Ymin)[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，要求總皂苷的含量越高越好，干膏得率越小越好。

2.4.2.1 模型擬合 以各總評(píng)歸一值對(duì)自變量進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件Statistica10.0，擬合方程如下，多元線性回歸方程:Y=－7.04524+0.0001X1+0.02559X2+0.9678X3，(r=0.7709)，F(xiàn)(3，6)=7.81。

二項(xiàng)式擬合方程為:Y=－79.88+1.3102X1+0.2057X2+5.1150X3－0.008－0.0006X1X2－0.0099X1X3－0.003X2X3(r=0.9799)。

從擬合方程的相關(guān)系數(shù)可見，多元線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)較低，表示自變量與因變量之間線性相關(guān)性較差，多元線性回歸擬合度不佳，預(yù)測(cè)性較差，因此該數(shù)學(xué)模型不合適。多元二項(xiàng)式擬合方程相關(guān)系數(shù)較高，擬合效果較好。剔除不可信的b7、b8、b9進(jìn)行重新擬合，得最終二項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型:Y=－79.88+1.3102X1+0.2057X2+5.1150X3－0.008(r=0.9702)，簡化后方程的r值降幅很小，說明此方程可信度較高。采用ANOVA分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)。方差分析表見表9，結(jié)果表明提取時(shí)間和溶劑倍量二次項(xiàng)達(dá)極顯著水平(P＜0.0001)，方程的擬合度和可信度均較好，與實(shí)際情況擬合度良好，可以對(duì)不同條件下提取結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化和預(yù)測(cè)。

表8 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.8 Central composite design and its results

2.4.2.2 效應(yīng)面優(yōu)化、預(yù)測(cè) 根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，繪制各考察指標(biāo)綜合得分與各自變量間的三維效應(yīng)曲面圖。把因變量與另兩因素?cái)M合為三維曲面圖，因只能表達(dá)含兩個(gè)因素變量的函數(shù)，故固定3個(gè)變量中的一個(gè)為中值，再以擬合的目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因變量曲面圖和等高線(圖4～6)，在圖上選取較佳工藝范圍X1:65%～75%，X2:10～12倍，X3:120～170 min，綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際情況，故選取提取桔梗中桔?？傇碥盏淖罴压に嚍?10倍量70%乙醇回流提取2次，每次140 min。

2.4.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際總皂苷平均含量為33.86 mg·g－1(n=3)，實(shí)際值比預(yù)測(cè)值高1.02%。說明建立的數(shù)學(xué)模型可靠，預(yù)測(cè)性良好。

表9 回歸模型的方差分析Tab.9 Variance analysis on the regression model

圖4 乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)總評(píng)OD值的三維效應(yīng)面圖及二維等高線圖Fig.4 3D predicted response surface and 2D contour line of ethanol concentration and distillation time versus total OD

圖5 乙醇濃度和溶劑倍量對(duì)總評(píng)OD值的三維效應(yīng)面圖及二維等高線圖Fig.5 3D predicted response surface and 2D contour line of ethanol concentration and solvent volume versus total OD

3 討論

圖6 提取時(shí)間和溶劑倍量對(duì)總評(píng)OD值的三維效應(yīng)面圖及二維等高線圖Fig.6 3D predicted response surface and 2D contour line of distillation time and solvent volume versus total OD

目前桔梗的提取工藝優(yōu)化多采用正交設(shè)計(jì)方法，本實(shí)驗(yàn)首次采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)桔?？傇碥者M(jìn)行提取工藝的考察，同時(shí)引入總評(píng)“歸一值”對(duì)多指標(biāo)進(jìn)行處理，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面優(yōu)化法所得結(jié)果更加直觀、便于分析，更適合于探索的實(shí)驗(yàn)研究，在最佳條件下效應(yīng)的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值偏差較小，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確度較高，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中更有優(yōu)勢(shì)，而正交設(shè)計(jì)受所選線性模型的限制，只能指出某一因素的取值方向，無法求得極值，往往選擇的條件均接近自變量的極大或極小值。綜上所述，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法更適合于桔?？傇碥盏奶崛」に?，此實(shí)驗(yàn)的研究為桔梗資源的進(jìn)一步合理開發(fā)、利用奠定了基礎(chǔ)。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:259.

[2]宋楊，齊云.桔梗的藥理研究進(jìn)展[J].中國藥房，2006，17(2):140－141.

[3]郭麗，張村，李麗，等.中藥桔梗的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2007，32(3):181－185.

[4]楊壯，田景奎，張琳.比色法測(cè)定桔梗中桔梗總皂苷的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2008，25(1):58－61.

[5]桂雙英，王舉濤，葉杰勝，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選桔?？傇碥盏奶崛」に嘯J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，30(5):63－64.

[6]袁玉霞，關(guān)延彬，周寧，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方左氧氟沙星原位凝膠的制備工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33(4).481－484.

[7]阮洪生，曹玲，陳志寶，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選金蕎麥提取工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32(2):226－229.

[8]李媛，張龍，崔榮輝，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選小兒健脾膏的提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(7):37－39.