姚瓊，董易之，徐淑，徐海明，陳炳旭

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，廣東廣州510640)

1998年 Fire等［1］將體外轉錄得到的單鏈 RNA(正義RNA(sense RNA)和反義RNA(anti-sense RNA))注射到線蟲Caenorhabditis elegans體內，發(fā)現(xiàn)兩者都能夠特異性阻斷相應基因的表達，誘導了特異性的基因沉默(gene silencing)，該小組將此現(xiàn)象稱為RNA干涉(RNA interference，簡稱RNAi)。目前，RNAi技術已在多種模式生物如線蟲(Caenorhabditis elegans)、果蠅 (Drosophila melanogaster)、小鼠(moth)等體內實現(xiàn)，通常是用dsRNA(double-stranded RNA)介導基因沉默作用，dsRNA作為RNAi作用的前導物質，對于干擾作用的發(fā)生起著決定性作用［2-4］。以dsRNA為基點研究基因沉默的分子機制成為熱點［5］。

在線蟲C.elegans中，只需導入少量的dsRNA即可實現(xiàn)高效的RNAi效果，但哺乳動物和果蠅中不存在RNAi的放大機制，即導入dsRNA后產(chǎn)生的RNAi作用不持久，具有瞬時性［6-7］。為了克服此缺點，研究者發(fā)展了基于DNA載體在動植物體內表達dsRNA的技術。這種載體可以是質粒，也可以是病毒，甚至可以是DNA片段［8-9］。先在體外構建能表達dsRNA的載體，再將載體轉到細胞內合成dsRNA，不但能增加有效轉染細胞的種類，而且在長期穩(wěn)定表達載體的細胞株中，dsRNA能夠長期穩(wěn)定表達，省時省力且高效［10-11］。因此，應用合適的表達載體表達dsRNA，對于采取喂食法和注射法實現(xiàn)的RNAi試驗起著至關重要的作用。

由于質粒L4440作為表達載體具有含有雙向T7強啟動子，載體本身具有氨芐抗性，便于篩選等優(yōu)點，目前已成功用于多種RNAi試驗所需dsRNA的表達［12-13］。在干擾載體構建完成后克隆至大腸桿菌HT115(DE3)中，該菌含有T7 RNA聚合酶基因(λDE3 lysogen)，它可在T7啟動子的控制下進行基因轉錄，產(chǎn)生T7 RNA聚合酶。而且該菌有一個rnc基因突變，它是編碼特異性降解dsRNA的內切酶RNaseⅢ的基因，有利于dsRNA的生成，這樣在IPTG誘導下在E.coli內很容易產(chǎn)生dsRNA，另外，該菌為四環(huán)素抗性，轉入載體后具有雙抗性，便于篩選［14-15］。因此，該表達系統(tǒng)的成功構建，可以快速經(jīng)濟地利用喂食法或注射法RNAi進行生物體某個基因功能的研究。

dsRNA作為RNAi作用的前體分子，在生物體中合適量的dsRNA對RNAi的效果起到了很重要的作用，而大腸桿菌又是用于表達外源基因的較好載體［12］。因此，利用大腸桿菌大量表達RNAi試驗所需的dsRNA并進一步優(yōu)化其表達條件是必要的。筆者利用帶有空載質粒L4440及重組質粒LSA3的表達工程菌HT115(DE3)，借助正交試驗設計優(yōu)化其表達dsRNA的條件(例如誘導溫度、時間等)，便于后續(xù)的以喂食法或注射法介導的RNAi在靶標生物體內的實現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 載體與菌株 菌株:HT115(DE3)，美國斯坦福大學Fire教授贈送(美國國家線蟲遺傳學研究中心提供)。

質粒L4440:美國斯坦福大學Fire教授贈送(美國麻省Addgene機構提供)。

有外源基因插入的質粒LSA3:在空載質粒L4440中插入甜菜夜蛾(spodoptera exigua)幾丁質合成酶A的一段長度為450 bp基因片段，該重構質粒由中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室提供。

1.2 試劑 蛋白胨(peptone)、酵母粉(yeast extract)購自Oxoid公司產(chǎn)品;氨芐青霉素(ampcillin)、四環(huán)素(Tetracycline)購自廣州威佳科技有限公司;DNA markerIII購自NEB公司;IPTG購自Merck公司;DEPC購自AMRESCO公司;Trizol購自天根生化科技(北京)有限公司;氯仿、異丙醇、乙醇及其他常用的化學試劑購自廣州化學試劑廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 目的基因在工程菌中的誘導表達。

1.3.1.1 正交試驗設計。大腸桿菌經(jīng)誘導表達外源基因的主要影響因素為誘導時間、誘導溫度及誘導劑濃度，采用L9(34)正交試驗表(表1)。

表1 正交試驗因素水平

1.3.1.2 目的基因的誘導表達。在2塊分別含LSA3、L4440質粒的大腸桿菌平板上，用無菌牙簽挑取一些白色菌落，分別接種到 3 ml LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/ml Amp、12.5 μg/ml Tet)中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 h，活化。然后以1∶50轉接至2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4左右時，按試驗號加入相應濃度IPTG，并根據(jù)各試驗號所需的條件誘導相應的時間及溫度。

1.3.2 菌體RNA的提取及檢測。菌體RNA抽提采用傳統(tǒng)的Trizol提取法，并在該方法上稍作調整。

RNA質量檢測手段包括瓊脂糖凝膠電泳檢測和分光光度計測定。稱取0.2 g Agrose溶于1×TAE緩沖液中，定容至20 ml，制成1%的電泳膠。將5 μl RNA樣品與1 μl 6×Loading Buffer充分混合后電泳檢測。將2 μl RNA樣品與498 μl DEPC水混勻(放大250倍)，利用分光光度計檢測，記錄樣品的OD260、OD260/OD280及RNA濃度。

2 結果與分析

2.1 工程菌富集量直觀對比 試驗組與對照組組間對比:根據(jù)3次重復中菌液富集量情況，LSA3組與L4440組菌量無明顯差異。試驗組與對照組組內對比:直觀上看，L4440組與LSA3組都存在一個現(xiàn)象，即25℃培養(yǎng)條件下富集得到的菌量普遍比30℃、37℃這2種培養(yǎng)條件下的菌量少，但30℃與37℃條件下培養(yǎng)所得到的菌液濃度無明顯差異。

2.2 菌體RNA的提取及RNA純度檢測 對3次重復所抽提的菌體RNA利用分光光度計檢測其純度，結果顯示，3次重復中所抽提的RNA純度較好，2個組OD260/OD280在1.7～2.00的樣品比例都為88.9%，說明樣品很少蛋白污染，且沒有RNA水解成單核苷酸的現(xiàn)象。

2.3 正交試驗結果 由表2可知，3個因素對結果的影響大小依次為A、B、C。即對于大腸肝菌HT115(DE3)生長誘導時間的作用最大，其次是誘導溫度，最后是誘導劑IPTG的濃度。

方差分析結果表明，3個因素對于試驗結果的影響并不顯著，誘導時間對于試驗結果有一定影響，而另外2個因素誘導時間與誘導劑濃度對試驗結果影響不明顯。

最佳組合為A3B2C3，即誘導時間8 h，誘導溫度30℃，誘導劑濃度10.0 mmol/L。

表2 正交試驗結果

3 結論與討論

先在體外構建能表達dsRNA的載體，再將載體轉到細胞內合成dsRNA，可保證在細胞株中長期穩(wěn)定表達dsRNA，有效發(fā)揮RNAi阻斷基因的效應［15-16］。該試驗選用E.coliHT115(DE3)(具有四環(huán)素抗性)作為材料，轉入含對應目標片段dsRNA的cDNA載體L4440(具有氨芐抗性)后具有雙抗性，便于篩選，這在IPTG誘導下在E.coli內很容易產(chǎn)生dsRNA。

大腸肝菌表達外源基因的影響因素很多，該試驗選用影響較大的幾項:誘導劑IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間。因為工程菌表達外源基因的條件因基因不同也相應不同，因此設定了這3個影響因素的3個水平以期得到E.coliHT115(DE3)表達目的基因的最優(yōu)條件。而試驗組LSA3收菌量略小于空白對照組L4440，可能的原因是:外源基因的存在對菌體的生長有一定影響。25℃培養(yǎng)條件下富集得到的菌量普遍比30℃、37℃這2種培養(yǎng)溫度下的菌量少，但30℃與37℃溫度下培養(yǎng)得到的菌量差別不大，造成這一現(xiàn)象可能的原因是工程菌E.coliHT115(DE3)的生長受溫度影響較大，25℃并不是其適宜生長溫度，其生長最適溫度是30～37℃。

正交試驗設計是一種解決多因素優(yōu)化問題的卓有成效的方法［17-20］。該試驗采用正交試驗設計研究了dsRNA在HT115(DE3)內的最優(yōu)表達條件。結果表明，最適合工程菌E.coliHT115(DE3)生長并表達dsRNA的最佳組合為A3B2C3，即誘導時間8 h、誘導溫度30℃，誘導劑濃度10.0 mmol/L。

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