樊衛(wèi)飛 王峻 王琳 孟麗娟 蒲驍麟 楊民 許菊青

惡性胸腹腔積液中腫瘤細(xì)胞的TSmRNA表達(dá)水平與培美曲塞藥物敏感性關(guān)系

樊衛(wèi)飛 王峻 王琳 孟麗娟 蒲驍麟 楊民 許菊青

目的 分析惡性胸腹腔積液中原代腫瘤細(xì)胞胸苷酸合成酶（TS）基因的mRNA表達(dá)水平，探討TS基因在惡性胸腹腔積液患者中對(duì)培美曲塞藥物化療療效的預(yù)測作用。 方法 收集39例經(jīng)病理確診的Ⅳ期惡性腫瘤患者的惡性胸腹腔積液，分離原代腫瘤細(xì)胞，采用ATP-TCA法體外藥物敏感試驗(yàn)檢測化療藥物對(duì)原代腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用；提取原代腫瘤細(xì)胞的總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測原代腫瘤細(xì)胞中培美曲塞藥物療效相關(guān)基因TS的相對(duì)表達(dá)水平。 結(jié)果 在惡性胸腹腔積液中，原代腫瘤細(xì)胞中TSmRNA的相對(duì)表達(dá)水平與惡性腫瘤患者的臨床特征無明顯相關(guān)性（P＞0.05）；TSmRNA表達(dá)水平與培美曲塞藥敏結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，TS低表達(dá)，培美曲塞更敏感（P＜0.05）。 結(jié)論 惡性胸腹腔積液中原代腫瘤細(xì)胞TSmRNA的表達(dá)水平與培美曲塞體外藥物敏感性相關(guān)。對(duì)于有惡性胸腹腔積液患者，可通過簡單的胸腹腔穿刺獲得與化療藥物療效相關(guān)的基因信息，從而為惡性胸腹腔積液患者實(shí)施個(gè)體化治療提供理論基礎(chǔ)。

胸苷酸合成酶；惡性胸腹腔積液；培美曲塞

惡性腫瘤的治療問題是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛關(guān)注的研究方向。由于腫瘤本身和不同病人之間腫瘤異質(zhì)性的存在，使得目前應(yīng)用的抗腫瘤藥物對(duì)≥70%的患者療效有限。檢測腫瘤的藥物敏感性基因，參考檢測結(jié)果選擇敏感的藥物進(jìn)行個(gè)體化治療，已經(jīng)成為當(dāng)前提高療效、減少無效治療的有效措施［1-2］。絕大多數(shù)晚期惡性腫瘤患者在疾病進(jìn)展過程中均會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，與原發(fā)灶相比，轉(zhuǎn)移灶具有不同的生物學(xué)行為。培美曲塞是新一代多靶點(diǎn)葉酸拮抗劑，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療中取得了較好的療效［3］，同時(shí)在胃腸消化道腫瘤治療中作為二線化療藥物的地位逐漸提高。胸苷酸合成酶（TS）是DNA合成的關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平可能與培美曲塞的療效相關(guān)［4-5］。

臨床上，惡性胸腹腔積液是一種易于獲取的標(biāo)本，相對(duì)于病情較晚無手術(shù)適應(yīng)證患者或者體力狀況較差、年齡較高無法耐受胃腸鏡、支氣管鏡、穿刺活檢等操作的患者顯得尤為重要。且對(duì)患者創(chuàng)傷較少，可重復(fù)操作，因此惡性胸腹腔積液在個(gè)體化療領(lǐng)域具有獨(dú)特的意義［6-8］。

本研究旨在探索：（1）腫瘤特殊轉(zhuǎn)移灶即惡性胸腹腔積液中腫瘤細(xì)胞的TSmRNA表達(dá)水平與培美曲塞藥物敏感性的關(guān)系；（2）惡性胸腹腔積液是否可以作為一種合適的標(biāo)本，以獲得藥物敏感性預(yù)測分子方面的信息，從而為實(shí)施個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 藥品與試劑：TRIzol試劑盒為GIBCO公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒 ExTaq R-PCR為TaKaRa產(chǎn)品；培美曲塞由江蘇豪森醫(yī)藥股份公司提供（國藥準(zhǔn)字 H20051288）；細(xì)胞活性螢光檢測試劑CellTiter-GIo Luminescent Cel Viability Assay為美國Promega公司產(chǎn)品；Taqman探針及引物為美國ABI公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 研究對(duì)象：收集2010年3月至2014年8月在我院經(jīng)病理確診的轉(zhuǎn)移性惡性胸腹腔積液患者共39例，男20例，女19例，年齡34～81歲，平均（61.0± 5.2）歲，其中包含NSCLC組17例，胃腸癌組22例，其中胃癌10例，腸癌12例。經(jīng)細(xì)胞涂片病理學(xué)檢查證實(shí)，惡性胸腹腔積液中腫瘤細(xì)胞含量≥50%；患者標(biāo)本收集前1月未接受過全身抗腫瘤治療或胸腹腔局部治療；需要記錄的基本項(xiàng)目（包括患者的病理資料，在病程中先后使用的化療藥物，以及使用療效，生存期）在病歷中完整記載。

1.2 方法

1.2.1 分離腫瘤細(xì)胞：將收集的惡性胸腔或腹腔積液離心；小心吸取中間白膜層至新管中加入紅細(xì)胞裂解液20 ml，用含抗生素的RPMI 1640洗滌細(xì)胞。

1.2.2 ATP-TCA法藥物敏感性測定：調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于96孔板，同時(shí)加入不同濃度的化療藥物，同時(shí)設(shè)立無藥對(duì)照組（MO）和ATP最大抑制對(duì)照組（MI），每組設(shè)12個(gè)平行孔。將培養(yǎng)板于37℃、5%二氧化碳飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育6 d后取出；加入CellTiter-GIo試劑，應(yīng)用Berthold Detection Systems微孔板光度計(jì)檢測熒光值，并計(jì)算各藥物濃度下腫瘤細(xì)胞的生長抑制率；抑制率（inhibition rate，IR）=［1-（實(shí)驗(yàn)組熒光值-MI熒光值）/（MO熒光值-MI熒光值）］×100%。藥物敏感指數(shù)為600表示最大范圍的細(xì)胞存活，即最小程度的藥物敏感；藥物敏感指數(shù)為0表示細(xì)胞完全死亡，即最大程度的藥物敏感。藥物敏感指數(shù)越小，說明細(xì)胞對(duì)該藥越敏感。

1.2.3 RNA提取及cDNA的合成：分離后的胸腹腔積液腫瘤細(xì)胞，參照Trizol的說明書提取細(xì)胞總RNA。配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄完成后，將cDNA置于-20℃保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將各組cDNA溶液分別與SYBRpPCR混合物、上下游引物、滅菌蒸餾水一起加樣。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，60℃退火，延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。TS引 物 序 列：5′-TCAGCGAGAACCCAGACC-3′。5′-CCAGTGGCAACATCCTTAA-3′；β-actin引物序列：5′-TATGACTTAGTTGCGTTACACC-3′。5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，瓊脂糖凝膠電泳30 min。凝膠圖像分析儀分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間定量資料比較分析采用t檢驗(yàn)，在分析相關(guān)基因表達(dá)水平與藥物敏感性的關(guān)系時(shí)，如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布或經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布則采用Pearson's相關(guān)分析，反之則采用Spearman相關(guān)性分析。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 18.0。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 惡性胸腹腔積液中培美曲塞藥物敏感指數(shù)與腫瘤細(xì)胞TSmRNA表達(dá)的相對(duì)定量 本研究中標(biāo)本收集、處理過程中嚴(yán)格無菌操作，ATP-TCA檢測得以在全部標(biāo)本中完成。TSmRNA在原代腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)以及培美曲塞在不同組別的藥物敏感指數(shù)見表1。原代腫瘤細(xì)胞對(duì)培美曲塞的敏感性與患者臨床病理特征：TSmRNA在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平低于在胃腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。TSmRNA的表達(dá)與患者的年齡、性別、原發(fā)腫瘤類型均無關(guān)。

表1 2組胸腹腔積液中培美曲塞藥物敏感指數(shù)與腫瘤細(xì)胞TSmRNA表達(dá)的相對(duì)定量

2.2 TSmRNA的表達(dá)和腫瘤對(duì)培美曲塞的敏感指數(shù)的相關(guān)性 TSmRNA的表達(dá)和腫瘤對(duì)培美曲塞的敏感指數(shù)呈顯著正相關(guān)（NSCLC組r=0.672，P=0.03；胃腸癌組r=0.506，P=0.048），即惡性胸腹腔積液中低表達(dá)TSmRNA者體外對(duì)于培美曲塞敏感性高。見圖1及圖2。

3 討論

圖1 NSCLC組TSmRNA表達(dá)及對(duì)培美曲塞敏感性的關(guān)系

圖2 胃腸癌組TSmRNA表達(dá)及對(duì)培美曲塞敏感性的關(guān)系

現(xiàn)有的多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)表明，肺癌細(xì)胞中TS高表達(dá)將降低其對(duì)培美曲塞的敏感性［9］。有研究發(fā)現(xiàn)采用培美曲塞為基礎(chǔ)的方案治療NSCLC，TS低表達(dá)患者的無疾病進(jìn)展期（PFS）明顯高于高表達(dá)者；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)低表達(dá)患者的總生存期（OS）也明顯高于高表達(dá)患者［10］。在本項(xiàng)研究中，我們首次試圖探索在特殊的腫瘤轉(zhuǎn)移灶即惡性胸腹水中腫瘤細(xì)胞TSmRNA表達(dá)水平與培美曲塞藥物敏感性的關(guān)系。既往研究多關(guān)注原發(fā)腫瘤，且檢測標(biāo)本大多數(shù)采集于化療前，而病人經(jīng)多周期化療后可產(chǎn)生一定程度耐藥性，而惡性胸腹腔積液在采集后立即行分子生物學(xué)檢測，具有實(shí)時(shí)性，可為實(shí)時(shí)個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不論在肺癌組還是在胃腸癌組，惡性胸腹腔積液中腫瘤細(xì)胞TSmRNA表達(dá)水平均與培美曲塞藥物敏感性呈負(fù)相關(guān)；即TSmRNA低表達(dá)者體外培美曲塞敏感性高。

總而言之，對(duì)于伴有惡性胸腹腔積液的進(jìn)展期NSCLC以及胃腸癌患者，有可能通過相對(duì)簡單、無創(chuàng)的胸腹腔穿刺獲得合適的標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)的分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)化療藥物敏感性的預(yù)測，為實(shí)施腫瘤的個(gè)體化治療帶來希望。當(dāng)然，由于體外藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果不能完全等同于體內(nèi)病人對(duì)該種藥物的反應(yīng)性，臨床前試驗(yàn)的結(jié)果仍然有待于在進(jìn)一步大樣本臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。但由于本研究的樣本量較少，其價(jià)值和可靠性尚需要更多研究結(jié)果的支持。

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Relationship between mRNA expression of thym idylate synthase（TS）in malignant p leural and peritoneal effusions and chemosensitivity to pemetrexed

FAN Wei-fei，WANG Jun，WANG Lin，MENG Li-juan，PU Xiao-lin，YANGMin，XU Ju-qing. Department ofOncology，Jiangsu Provincial Geriatric Hospital，Nanjing 210024，China

Objective To explore themRNA expression of thymidylate synthase（TS）in tumor cells isolated from malignant pleural and peritoneal effusions，and to investigate the predictive role of TS to the efficacy of pemetrexed-based chemotherapy. M ethods Tumor cells were isolated from malignant pleural and peritoneal effusions of 39 patients with malignant tumor.Viable tumor cells were tested for sensitivity to pemetrexed using ATP-TCA assay.RT-PCR was used to examine the TS mRNA level in the primary cultured cancer cells. Results The expression level of TS mRNA in malignant effusions was negatively correlated with pemetrexed sensitivity.The expression of TSmRNA was not related to age，gender or tumor type. Conclusions The results indicate that the expression level of TS mRNA in malignant effusions is negatively correlated with sensitivity to pemetrexed.Chest or abdominal puncturemay play an important role for “real-time”individualized chemotherapy while tumor progression.

thymidylate synthase；malignant pleural and peritoneal effusions；pemetrexed

R 734

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.09.011

江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研面上項(xiàng)目（H201329）；江蘇省六大高峰項(xiàng)目（2013-WSN-057）

210024江蘇省南京市，江蘇省老年醫(yī)院腫瘤科

2015-03-10）