師　　雯，韓　　錚，武愛波，王周平（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫141；.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海01403）

溫度和pH對(duì)不同鐮刀菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響

師雯1，2，韓錚2，武愛波2，王周平1，*
（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海201403）

以從小麥、玉米、大米、大麥等作物中分離得到的12株不同種類的鐮刀菌菌株為研究對(duì)象，探究不同溫度和pH對(duì)其生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響。結(jié)果表明，鐮刀菌在10～35℃和pH3～11范圍內(nèi)均能夠生長(zhǎng)，最適溫度為20～30℃，最適pH為6～8。供試鐮刀菌能夠產(chǎn)生的毒素主要為A型單端孢霉烯族毒素、B型單端孢霉烯族毒素、伏馬毒素和鐮刀菌酸，產(chǎn)毒溫度為5～40℃，但不同菌株的最適產(chǎn)毒溫度存在差異；產(chǎn)毒過(guò)程受pH影響較大，過(guò)酸（pH3～5）及過(guò)堿（pH9～11）的條件下均未檢測(cè)到任何毒素?？傮w上看，不同種類鐮刀菌產(chǎn)毒類型存在差異，毒素產(chǎn)量受溫度和pH影響比生長(zhǎng)更大，且大多數(shù)菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)毒最適條件并不一致。

鐮刀菌，溫度，pH，生長(zhǎng)，產(chǎn)毒

鐮刀菌屬（Fusarium Link.）為半知菌類真菌，瘤座孢科，叢梗孢目，因大型分生孢子多呈鐮刀狀而得名［1］，其種類較多，地理分布極廣，兼寄生或腐生生活，普遍存在于土壤及動(dòng)植物有機(jī)體內(nèi)，是農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物最重要的病原菌之一；它們對(duì)寄主植物具有一定生理活性和非專化性作用位點(diǎn)，破壞植物細(xì)胞膜及超微結(jié)構(gòu)［2］，造成萎蔫、根腐、穗腐等病害，如Fusarium graminearum、Fusarium equiseti能引起小麥和大麥赤霉??；Fusarium verticilloides［3］、Fusarium proliferatum［4］可引起玉米穗腐?。籉usarium oxysporumSchlecht可引起瓜類、茄科、豆科等多種植物枯萎?。?］等，導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重影響品質(zhì)和食用價(jià)值［6］。鐮刀菌在自然生長(zhǎng)過(guò)程中還能產(chǎn)生多種真菌毒素，通過(guò)食品、飼料等途徑進(jìn)入食物鏈，侵染大米、玉米等谷物，食用油、面包、啤酒等農(nóng)產(chǎn)品加工品，以及蛋、奶、肉等畜產(chǎn)品，導(dǎo)致人類和動(dòng)物食物中毒甚至死亡［7］。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，全世界每年由于鐮刀菌及其毒素侵染農(nóng)作物和工業(yè)原料使各國(guó)遭受的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)千億美元［8-9］，因此鐮刀菌引起的作物病害及其毒素給人類和動(dòng)物飲食安全帶來(lái)的危害已成為不可忽視的問(wèn)題，明確其生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的環(huán)境因素是有效控制鐮刀菌及其毒素的關(guān)鍵。

鐮刀菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒與外界環(huán)境條件密切相關(guān)［10］，本實(shí)驗(yàn)以從小麥、玉米、大米、大麥等作物中分離得到的12株不同種類的鐮刀菌為研究對(duì)象，系統(tǒng)地探究不同溫度及pH對(duì)其生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響，明確最適生長(zhǎng)和產(chǎn)毒條件，及產(chǎn)毒類型的種間差異，為鐮刀菌引起的植物病害及食品儲(chǔ)存中毒素污染的防治技術(shù)提供一定理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試鐮刀菌菌株信息見表1，均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所提供，實(shí)驗(yàn)前于4℃保存在PDA斜面上；甲醇、乙腈色譜純，德國(guó)Merck公司；醋酸銨色譜純，上海安普生物科技有限公司；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）；脫氧雪腐鐮刀烯醇（DON）、3-乙?；撗跹└牭断┐迹?-ADON）、15-乙?；撗跹└牭断┐迹?5-ADON）、雪腐鐮刀烯醇（NIV）、鐮刀菌烯酮-X（Fus-X）、T-2毒素（T-2）、HT-2毒素（HT-2）、新茄鐮刀孢醇（NEO）、蛇形毒素（DAS）、伏馬毒素B1（FB1）、伏馬毒素B2（FB2）、鐮刀菌酸（Fusaric acid）標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)Sigma公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1000 mL、自然pH，121℃滅菌20 min；馬鈴薯葡萄糖肉湯（Potato Dextrose Broth，PDB）馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，121℃滅菌20 min。

表1　供試鐮刀菌菌株信息Table 1　Information of Fusarium strains in this study

MJ-250F-1霉菌培養(yǎng)箱、DHG-9240A鼓風(fēng)干燥機(jī)上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PE20pH計(jì)上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SX-500TOMY高壓滅菌鍋上海田源生物技術(shù)有限公司；LCMS-8030三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀日本島津（SHIMAADAU）有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株活化將4℃封存于PDA斜面上的鐮刀菌菌株分別接種于新配制的PDA固體培養(yǎng)基平板，25℃活化培養(yǎng)7 d；再將活化后的各菌株菌絲轉(zhuǎn)接于新配制的PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d，保證菌種活力，并用滅菌打孔器從新鮮菌落邊緣切取直徑為6 mm的菌餅，用于接種。

1.2.2溫度對(duì)鐮刀菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定溫度對(duì)鐮刀菌生長(zhǎng)的影響。將15 mL PDA培養(yǎng)基倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，每皿正中接入一塊菌餅，菌絲面朝下，分別于5、10、15、20、25、30、35和40℃的溫度條件下恒溫培養(yǎng)，相對(duì)濕度保持恒定，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，以兩次測(cè)量的平均值作為測(cè)量結(jié)果，減去菌餅直徑（6 mm）即為菌落直徑；再將PDA培養(yǎng)基連同已知質(zhì)量的培養(yǎng)皿一同從培養(yǎng)箱中取出，并于40℃的烘箱中烘烤48～60 h后稱重，當(dāng)培養(yǎng)基的質(zhì)量烘至1.0 g時(shí)，從培養(yǎng)皿中取出，移至50 mL離心管，搗碎并進(jìn)行毒素提取和測(cè)定。

1.2.3pH對(duì)鐮刀菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的影響采用菌絲體干重法測(cè)定pH對(duì)鐮刀菌生長(zhǎng)的影響。將100 mL PDB培養(yǎng)基分裝入250 mL三角錐瓶中，滅菌后用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液和0.05 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L NaOH緩沖液）將pH分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10和11。每瓶接入一塊菌餅，于25℃下恒溫靜置培養(yǎng)，相對(duì)濕度保持恒定，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)7 d后，用已知質(zhì)量的無(wú)菌濾紙濾去培養(yǎng)基，收集菌絲體，于40℃下烘干至恒重，準(zhǔn)確稱量，減去濾紙質(zhì)量即為菌絲體干重；將培養(yǎng)基濾液振蕩均勻，吸取1.0 mL于50 mL離心管中進(jìn)行毒素提取和測(cè)定。

1.2.4LC-MS/MS毒素檢測(cè)方法鐮刀菌毒素提取和檢測(cè)均采用本實(shí)驗(yàn)室前期已建立的LC-MS/MS分析檢測(cè)技術(shù)，樣品前處理、色譜及質(zhì)譜參數(shù)參照文獻(xiàn)［11］。

1.3數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS17.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）和Graphpad prism 5.0（Graphpad Software，Inc.，San Diego，CA）等統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析整理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示，數(shù)據(jù)間差異顯著水平以p＜0.05表示。

2　結(jié)果與討論

2.1溫度和pH對(duì)鐮刀菌生長(zhǎng)影響

2.1.1溫度對(duì)生長(zhǎng)影響鐮刀菌菌株在不同溫度條件下培養(yǎng)7 d后的菌落直徑見表2，由結(jié)果可知，同一溫度下不同菌株的生長(zhǎng)速率存在差異（p＜0.05），但不同溫度下的生長(zhǎng)趨勢(shì)具有相對(duì)一致性。鐮刀菌對(duì)溫度適應(yīng)范圍較寬，菌絲在10～35℃溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)；但對(duì)溫度變化較為敏感，不同培養(yǎng)溫度下同一菌株的菌落擴(kuò)展速率差異顯著（p＜0.05），其中20～30℃為最適宜生長(zhǎng)溫度范圍，菌絲生長(zhǎng)較快，除F.tricinctum最適生長(zhǎng)溫度為20℃外，其他菌株均為25℃；溫度低于20℃或高于30℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)逐漸緩慢；而當(dāng)溫度降至5℃或達(dá)到40℃時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)。

表2　不同溫度對(duì)鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響（n=3）Table 2　Effect of different temperatures on mycelia growth of Fusarium fungi（n=3）

表3　不同pH對(duì)鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響（n=3）Table 3　Effect of different pH values on mycelia growth of Fusarium（n=3）

2.1.2pH對(duì)生長(zhǎng)影響鐮刀菌菌株在不同pH條件下培養(yǎng)7 d后的菌絲體干重見表3。由結(jié)果可知，同一pH下不同菌株生長(zhǎng)速率存在差異（p＜0.05），但不同pH下的生長(zhǎng)趨勢(shì)具有相對(duì)一致性。鐮刀菌生長(zhǎng)對(duì)pH要求不嚴(yán)格，pH3～11范圍內(nèi)均能夠生長(zhǎng)；但在不同pH條件下，同一菌株的菌絲體干重差異顯著（p＜0.05），其中pH6～8為最適宜生長(zhǎng)酸堿度，但各菌株最適生長(zhǎng)pH存在差異；當(dāng)pH小于6或大于8時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)逐漸緩慢，表明過(guò)酸或過(guò)堿的培養(yǎng)環(huán)境不利于鐮刀菌的生長(zhǎng)，而中性或中性略偏酸堿的環(huán)境則能使其更好生長(zhǎng)。

2.2溫度及pH對(duì)鐮刀菌產(chǎn)毒影響

2.2.1溫度對(duì)產(chǎn)毒影響不同種類的鐮刀菌產(chǎn)生毒素的種類不相同，主要包括B型單端孢霉烯族毒素（NIV、Fus-X、DON、3-ADON及15-ADON）（圖1）、A型單端孢霉烯族毒素（T-2、HT-2、NEO及DAS）（圖2）、伏馬毒素（FB1、FB2）及鐮刀菌酸（Fusaric acid，圖3～圖4）；同一種鐮刀菌毒素可由多種鐮刀菌產(chǎn)生，每種鐮刀菌的產(chǎn)毒種類也并不單一。

從圖1~圖3可知對(duì)大多菌株而言，溫度為5℃時(shí)，不產(chǎn)毒或產(chǎn)毒量很低；溫度從5℃升高至15℃，產(chǎn)毒量隨溫度升高而緩慢增加；在20～35℃范圍內(nèi)，各菌株的產(chǎn)毒量顯著升高，并達(dá)到產(chǎn)毒最高點(diǎn)；溫度達(dá)到40℃時(shí)，產(chǎn)毒量回落到底點(diǎn)。然而，F(xiàn).langsethiae和F.sporotrichioides的產(chǎn)毒趨勢(shì)有所不同（圖2），溫度為10～25℃時(shí)，兩株菌株的產(chǎn)毒量達(dá)到高點(diǎn)，而在25～35℃溫度范圍內(nèi)，產(chǎn)毒量則很低。對(duì)比不同溫度條件下不同鐮刀菌的產(chǎn)毒情況，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)鐮刀菌產(chǎn)毒的影響比對(duì)生長(zhǎng)的影響更加復(fù)雜，并且不同菌株的最適產(chǎn)毒溫度及產(chǎn)毒能力存在明顯差異。

圖1　不同溫度對(duì)產(chǎn)B型單端孢霉烯族毒素鐮刀菌產(chǎn)毒的影響Fig.1　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of type-B trichothecenes producer

2.2.1.1產(chǎn)B型單端孢霉烯族毒素菌株由圖1可知，F(xiàn).culmorum、F.poae及F.meridionale主要產(chǎn)生NIV和Fus-X兩種毒素，F(xiàn).graminearum能夠產(chǎn)生DON及其乙?；苌?。F.culmorum在20℃時(shí)產(chǎn)毒量最大（NIV：212.00 μg/kg，F(xiàn)us-X：43.74 μg/kg），30℃次之；F.poae在25℃時(shí)產(chǎn)毒水平最高（NIV：612.71 μg/kg，F(xiàn)us-X：135.75 μg/kg）；F.meridionale則在30℃時(shí)具有最大產(chǎn)毒量（NIV：346.53 μg/kg，F(xiàn)us-X：38.57 μg/kg），且顯著高于25℃和35℃；而F.graminearum的最適產(chǎn)毒溫度則為30℃（DON：15919.70 μg/kg，3-ADON：7763.06 μg/kg，15-ADON：5194.82 μg/kg）。

圖2　不同溫度對(duì)產(chǎn)A型單端孢霉烯族毒素鐮刀菌產(chǎn)毒的影響Fig.2　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of type-A trichothecenes producer

2.2.1.2產(chǎn)A型單端孢霉烯族毒素菌株由圖2可知，F(xiàn).langsethiae、F.sporotrichioides和F.polyphialidicum主要產(chǎn)A型單端孢霉烯族毒素。F.langsethiae在15℃時(shí)產(chǎn)毒量最高（T-2：5089.32 μg/kg，HT-2：347.10 μg/kg，DAS：411.799 μg/kg，NEO：2478.05 μg/kg），20℃次之；F.sporotrichioides和F.polyphialidicum的最適產(chǎn)毒溫度分別為15℃和25℃。

2.2.1.3同時(shí)產(chǎn)伏馬毒素（FB1、FB2）和鐮刀菌酸菌株由圖3可知，F(xiàn).fujikuroi、F.proliferatum和F.verticillioides能夠同時(shí)產(chǎn)生FB1、FB2和鐮刀菌酸。F.fujikuroi的最適產(chǎn)毒溫度為25℃（FB1：17.15 μg/kg，F(xiàn)B2：3.43 μg/kg，鐮刀菌酸：2.06 μg/kg），其次為30℃；F.proliferatum和F.verticillioides則在30℃時(shí)產(chǎn)毒量最大。

圖3　不同溫度對(duì)同時(shí)產(chǎn)伏馬毒素和鐮刀菌酸的鐮刀菌產(chǎn)毒的影響Fig.3　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of fumonisins and fusaric acid producer

圖4　不同溫度對(duì)產(chǎn)鐮刀菌酸的鐮刀菌產(chǎn)毒的影響Fig.4　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of fusaric acid producer

2.2.1.4產(chǎn)鐮刀菌酸菌株由圖4可知，F(xiàn).tricinctum和F.oxysporum僅檢測(cè)到鐮刀菌酸一種毒素。30℃為F.tricinctum的最適產(chǎn)毒溫度，產(chǎn)毒量為171.93 μg/kg，其次是25℃；而F.oxysporum的最適產(chǎn)毒溫度則為35℃，產(chǎn)毒量為212.98 μg/kg。

值得注意的是，大多數(shù)菌株的產(chǎn)毒最適溫度與各自的最佳生長(zhǎng)溫度不一致；尤其在10～20℃和30～35℃溫度范圍內(nèi)，有些菌株的生長(zhǎng)水平逐漸降低，但產(chǎn)毒水平依然較高。Ramirez等［12］發(fā)現(xiàn)小麥培養(yǎng)基中，F(xiàn).graminearum最佳生長(zhǎng)溫度為25℃，DON的最大產(chǎn)毒量溫度為30℃，此時(shí)菌株的生長(zhǎng)速率顯著降低；Nazari等［13］報(bào)道F.langsethiae和F.sporotrichioides的最適生長(zhǎng)溫度分別為20～25℃和25～30℃，而最適產(chǎn)毒溫度則為10～15℃，此時(shí)菌株生長(zhǎng)極為緩慢；這些報(bào)道與本文研究結(jié)果一致，可見食品及飼料中即使沒有明顯的菌株生長(zhǎng)跡象，但可能已存留了大量真菌毒素；此外，低溫條件下（5℃）菌絲生長(zhǎng)基本停止，但部分鐮刀菌仍然能夠產(chǎn)生少量毒素，說(shuō)明食物長(zhǎng)期低溫存放也并非絕對(duì)安全。

鐮刀菌毒素是鐮刀菌在自然生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，也可認(rèn)為是其因外界環(huán)境改變而產(chǎn)生的適應(yīng)反應(yīng)，因此其毒素的產(chǎn)生往往同細(xì)胞生長(zhǎng)及外界環(huán)境等因素密切相關(guān)［7］；可能正是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)利于菌株生長(zhǎng)的物質(zhì)和參與毒素合成的代謝物對(duì)不同溫度的敏感程度不同，從而導(dǎo)致各菌株的最適生長(zhǎng)與產(chǎn)毒條件存在差異。

2.2.2pH對(duì)產(chǎn)毒影響鐮刀菌的產(chǎn)毒對(duì)酸堿度較為敏感，pH3～5和pH9～11范圍內(nèi)均未檢測(cè)到任何毒素；產(chǎn)毒主要出現(xiàn)在pH6～8范圍內(nèi)（表4），與生長(zhǎng)適宜范圍一致，表明中性或中性略偏酸堿的環(huán)境有利于鐮刀菌的產(chǎn)毒，但最佳產(chǎn)毒pH與各自最佳生長(zhǎng)pH依然存在差異。

表4　不同pH下鐮刀菌產(chǎn)毒水平（n=3）Table 4　Levels of mycotoxins produced by Fusarium under different pH values（n=3）

3　結(jié)論

分析不同溫度和pH對(duì)鐮刀菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒情況的影響，結(jié)果表明，相同培養(yǎng)條件下不同鐮刀菌的生長(zhǎng)速率存在差異，但在不同溫度或pH下的生長(zhǎng)趨勢(shì)具有相對(duì)一致性，鐮刀菌在10～35℃和pH3～11范圍內(nèi)均能夠生長(zhǎng)，最適溫度及pH范圍為20～30℃和pH6～8。不同鐮刀菌產(chǎn)毒類型存在差異，產(chǎn)毒溫度為5～40℃，但不同菌株之間最適產(chǎn)毒溫度不相同；產(chǎn)毒過(guò)程受pH影響較大，過(guò)酸（pH3～5）及過(guò)堿（pH9～11）的條件下均未檢測(cè)到任何毒素。因此，鐮刀菌毒素的產(chǎn)生受溫度和pH影響比生長(zhǎng)更大，且大多數(shù)菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)毒最適條件并不一致。由于本研究中得到的鐮刀菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒適宜條件與很多作物栽培區(qū)的環(huán)境條件基本一致［14-15］，建議在作物種植時(shí)，適當(dāng)調(diào)節(jié)土壤酸堿度（pH），及時(shí)修剪殘株病枝，注意鐮刀菌病害的防控；食品及飼料儲(chǔ)存時(shí)也要注意溫度控制，減少鐮刀菌毒素的產(chǎn)生和蔓延；該研究結(jié)果也為鐮刀菌及其毒素發(fā)生規(guī)律的進(jìn)一步研究提供了一定理論依據(jù)。

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Effect of temperature and pH on the growth and mycotoxins production of various Fusarium species

SHI Wen1，2，HAN Zheng2，WU Ai-bo2，WANG Zhou-ping1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Institute for Agri-food Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

In order to investigate the influences of temperature and pH value on the growth and mycotoxins production of various Fusarium species，a total of 12 strains，which isolated from wheat，maize，rice and barley，were studied in present study.The results showed that a wide range of 10～35℃and pH3～11 suitable for their growth were observed，and the optimum temperatures and pH values range were 20～30℃ and pH6～8. Different types of mycotoxins including type-A trichothecenes，type-B trichothecenes，fumonisins and fusaric acid were produced by the Fusarium investigated in current study.The temperature for the mycotoxins production was in the range of 5～40℃.The mycotoxin production were significantly affected by the variation in pH values，and peracid（pH3～5）or parlkaline（pH9～11）conditions would inhibit mycotoxins synthesis.On the whole，the mycotoxins production profiles were various between different Fusarium species，and more effects of temperature and pH values were observed on the mycotoxins production than that on the growth of fungi.For most Fusarium strains，the optimum conditions for mycotoxins production were inconsistent with the Fusarium growth itself.

Fusarium；temperature；pH；growth；mycotoxin production

TS201.6

A

1002-0306（2015）18-0117-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.015

2015－02－02

師雯（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測(cè)，E-mail：sw1596321@sina.com。

王周平（1974-），男，教授，研究方向：食品安全檢測(cè)，E-mail：wangzp@jiangnan.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31471661）。