何永禮　王欣　施福田　嚴(yán)秋亮　朱錦輝★

Aurora-A在胰腺癌的表達(dá)及與吉西他濱耐藥的相關(guān)性研究

何永禮王欣施福田嚴(yán)秋亮朱錦輝★

目的 探討Aurora-A的表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥的相關(guān)性。方法 qPCR法測定PANC-1和耐藥細(xì)胞株P(guān)ANC-1/R2 中Aurora-A mRNA的表達(dá)；分別用PANC-1和PANC-1/R2建立胰腺癌動物模型，免疫組化方法測定瘤體Aurora-A的表達(dá)。結(jié)果 PANC-1組模型第5周腫瘤轉(zhuǎn)移率36.8%（7/19），裸鼠體重（23.2±1.41）g，腫瘤重量（0.453±0.110）g；PANC-1/R2組模型第5周腫瘤轉(zhuǎn)移率50%（9/18），裸鼠體重（22.91±1.13）g，腫瘤重量（0.564±0.203）g。轉(zhuǎn)移率和腫瘤質(zhì)量兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PANC-1組Aurora-A mRNA表達(dá)為（1.002±0.040）；PANC-1/R2組Aurora-A mRNA表達(dá)為（1.845±0.069），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PANC-1/R2組18例標(biāo)本組織中Aurora-A蛋白陽性表達(dá)15例（83.3%）；PANC-1組19例組織的Aurora-A蛋白檢測陽性表達(dá)11例（57.9%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 Aurora-A基因高表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞株的吉西他濱耐藥有關(guān)，新方法構(gòu)建的PANC-1/R2耐藥株Aurora-A基因高表達(dá)，可用于胰腺癌吉西他濱耐藥研究的載體。

Aurora-A激酶 胰腺癌 多藥耐藥 吉西他濱

胰腺癌是常見的病死率較高的惡性腫瘤之一，化療效果不理想，作為胰腺癌的首選藥物的吉西他濱，其化療有效率僅25%［1］，多種耐藥是導(dǎo)致化療效果欠佳的重要原因。研究表明Aurora-A激酶作為一種DNA修復(fù)功能的蛋白，具有參與修復(fù)DNA的作用。目前發(fā)現(xiàn)在食道管癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等中，抑制Aurora-A激酶的表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤的化療敏感性［2～4］。本文探討Aurora-A激酶表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥的關(guān)系，報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性BALB/c裸小鼠由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供和飼養(yǎng)，鼠齡4周，體質(zhì)量18～20g，飼養(yǎng)于恒溫（25～27℃），恒濕（45%～50%），符合SPF條件的裸鼠室內(nèi)，飲用水及標(biāo)準(zhǔn)食療均經(jīng)滅菌后供動物自由食用。

1.2細(xì)胞株 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科研究所提供。

1.3主要儀器和試劑 qPCR儀（Biorad公司），IS1000凝膠成像系統(tǒng) （美國法莫西亞公司），Beckman Coul ter Avanti J-20低 溫 離 心 機(jī)（ 德 國Heraeus Inc），鼠抗人Aurora-A單克隆抗體（Santa Crus Biotechnology，Inc），Taq DNA聚 合 酶（ 日 本Takara公司），RNA酶抑制劑（美國Promega公司），ABC免疫組化檢測試劑盒（華美生物工程公司）。

1.4qPCR測定mRNA 以提取的RNA進(jìn)行擴(kuò)增。其引物序列及目的片段的長度見表1。qPCR程序：樣品裂解提取RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-Time PCR，預(yù)變性95℃，1min；之后每一步變性95℃，5s；退火延伸60℃，20s；共進(jìn)行40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。選擇明亮條帶的產(chǎn)物進(jìn)行正反向測序，電壓設(shè)定120V，電流60mA，然后在自動凝膠成像系統(tǒng)上成像觀察擴(kuò)增結(jié)果。

表1　Aurora -A引物序列

1.5組織標(biāo)本獲取 用PANC-1和PANC-1/R2 分別通過皮下移植再原位移植構(gòu)建胰腺癌動物模型，每組各20例，所有裸鼠每天檢查、每周稱重，于制模后第35d稱重后處死。收集腫瘤病灶及淋巴結(jié)和內(nèi)臟等標(biāo)本組織。胰腺腫瘤組織在拭干表面水分后立即在電子稱上稱重并記錄，游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積并記錄。標(biāo)本取下后作好標(biāo)記，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，并將腫瘤組織1塊（用于免疫組化染色），并立即置入液氮罐中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。其余腫瘤組織石蠟包埋切片HE染色。所有腫瘤組織均得到病理切片證實(shí)。

1.6免疫組化 免疫組織化學(xué)染色程序按試劑盒說明書進(jìn)行，磷酸緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。Aurora-A蛋白免疫組化陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。本實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性和陰性對照黃色顆粒。在光學(xué)顯微鏡下觀察全片，對切片染色陽性情況進(jìn)行評估，結(jié)果判定參照文獻(xiàn)進(jìn)行［3］。隨機(jī)選取5個高倍視野，依據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量、百分率，表達(dá)強(qiáng)度分為四級：0級：無明顯陽性反應(yīng)細(xì)胞。Ⅰ級：陽性細(xì)胞＜25%、弱染色。Ⅱ級：陽性細(xì)胞在25%～75%之間。Ⅲ級：陽性細(xì)胞＞75%、強(qiáng)染色。0～Ⅰ級為陰性表達(dá)；Ⅱ～Ⅲ級為陽性表達(dá)。在顯微鏡下取不同放大倍數(shù)，拍照、保存結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 14.0 統(tǒng)計(jì)軟件。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 PANC-1組和PANC-1/R2組裸鼠的體重、腫瘤質(zhì)量及轉(zhuǎn)移率比較 見表2。

表2　PANC-1組和PANC-1/R2組裸鼠的體重、腫瘤質(zhì)量及轉(zhuǎn)移率比較（x±s）

2.2Aurora-A mRNA在 PANC-1組 和 PANC-1/ R2組中的表達(dá) 通過qPCR技術(shù)檢測PANC-1和PANC-1/R2細(xì)胞株Aurora-A mRNA的表達(dá)情況，PANC-1組Aurora-A mRNA表達(dá)是（1.002±0.040）；PANC-1/R2組 Aurora-A mRNA是（1.845±0.069），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3Aurora-A蛋白在PANC-1和PANC-1/R2組中陽性表達(dá)率比較 見表3、圖2。

圖1　兩組細(xì)胞株Aurora-A mRNA的表達(dá)情況

表3　Aurora-A蛋白在PANC-1和PANC-1/R2組中陽性表達(dá)率比較［n（%）］

圖2　Aurora-A胰腺癌陽性表達(dá)免疫組化

3　討論

Aurora-A激酶是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)中心體、微管功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在中心體成熟、紡錘體形成、染色體分離，即有絲分裂的正常進(jìn)行中發(fā)揮重要的作用。目前，Aurora-A已被認(rèn)為是一個與多種惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)的癌基因。當(dāng)前眾多研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-A在乳腺癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)［5，6］。其表達(dá)水平與腫瘤的組織學(xué)分級、臨床分期和患者預(yù)后具有相關(guān)性［7］。抑制Aurora-A激酶活性，可有效阻礙細(xì)胞的生長、增殖，并引起腫瘤細(xì)胞的凋亡［8］。當(dāng)腫瘤細(xì)胞面對化療藥物的作用下出現(xiàn)DNA的損傷，而Aurora-A恰能對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，從而出現(xiàn)耐藥。研究表明Aurora-A的高表達(dá)是產(chǎn)生腫瘤耐藥的重要因素［9，10］。既往的研究著重于Aurora-A的表達(dá)與腫瘤及預(yù)后的關(guān)系，如Sakakura 等［11］報(bào)道，存在Aurora-A 基因擴(kuò)增的原發(fā)性胃癌患者比未發(fā)現(xiàn)Auror a-A 基因擴(kuò)增的患者預(yù)后更差。Warner 等［12］比較Aurora-A和Aurora-B 作為胰腺癌抗癌治療的分子靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)以Aurora-A 為靶點(diǎn)治療可能在有絲分裂停滯和快速誘導(dǎo)程序性死亡方面，優(yōu)于針對Aurora-B 為靶點(diǎn)的治療。但缺乏通過構(gòu)建耐藥細(xì)胞株及耐藥動物模型，以此作為研究平臺評估Aurora-A表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥的關(guān)系，并評價其與轉(zhuǎn)移方式和轉(zhuǎn)移率的關(guān)系。

PANC-1/R2細(xì)胞株是通過體外培養(yǎng)體內(nèi)誘導(dǎo)方式，循環(huán)兩輪后獲得的耐藥細(xì)胞株。用此細(xì)胞株和PANC-1細(xì)胞株構(gòu)建胰腺癌模型，發(fā)現(xiàn)兩者的生物學(xué)行為并不相同，PANC-1/R2惡性程度更高，表現(xiàn)在該組的瘤體重量更重，而裸鼠的體重相對輕，但胰腺癌的轉(zhuǎn)移率明顯升高，達(dá)50%，而PANC-1為36.8%。提示耐藥的胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)惡性程度也相應(yīng)提高。本資料結(jié)果表明，蛋白水平和基因水平均證實(shí)Aurora-A的表達(dá)與胰腺癌吉西他濱的耐藥有關(guān)，具體為耐藥細(xì)胞Aurora-A高表達(dá)，敏感細(xì)胞Aurora-A低表達(dá)，證實(shí)Aurora-A的表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥有關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符合。Aurora-A如何參與腫瘤的發(fā)生和耐藥產(chǎn)生，目前有較多觀點(diǎn)。認(rèn)為Aurora-A過表達(dá)能夠在Cdc20-BubR1 相互作用的水平上，通過干擾有絲分裂檢測點(diǎn)復(fù)合物的恰當(dāng)組裝導(dǎo)致基因不穩(wěn)定和腫瘤生長［1］。目前多藥耐藥的機(jī)制尚不明確，宏觀上講與腫瘤細(xì)胞的自我吞噬增強(qiáng)自身抵抗力以及減少凋亡有關(guān)。Aurora-A參與自噬調(diào)節(jié)的研究不多，但已報(bào)道的研究結(jié)果表明Aurora-A可以通過自噬的途徑誘導(dǎo)腫瘤的耐藥。Zou［13］的研究發(fā)現(xiàn)Aurora-A陽性表達(dá)的乳腺腫瘤組織中自噬相關(guān)蛋白SQSTM1呈現(xiàn)高表達(dá)，該研究通過小分子VX-680或sRNA干擾抑制Aurora-A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II（LC3-II）和自噬體明顯增加，而SQSTM1明顯降低；而過度表達(dá)Aurora-A則抑制自噬。Aurora-A通過負(fù)向調(diào)節(jié)自噬的途徑發(fā)揮誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞自噬性的凋亡。該研究結(jié)果提示Aurora-A的高表達(dá)抑制自噬，低表達(dá)誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生對藥物的耐藥，這與本研究結(jié)果不符合，推測自噬在耐藥產(chǎn)生中并非主導(dǎo)作用。而Hamidi［14］研究表明Nupr1通過調(diào)節(jié)Aurora-A激酶對抗因缺氧及糖饑餓引起的自噬性的細(xì)胞程序性死亡，提示非DNA損傷性的抗癌藥物耐藥可能與Aurora-A有關(guān)。p53、PP1、Cyclin B1-cdc2、BRCA1、RasGA P、Survivin、c-myc與Aurora-A的相互作用是導(dǎo)致胰腺癌發(fā)生耐藥的可能原因?？梢?，Aurora-A參與腫瘤形成及多藥耐藥的機(jī)制研究較多，機(jī)制復(fù)雜，但目前與自噬相關(guān)的較少，而其作用逐步得到認(rèn)識，具有廣闊的研究前景。

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10El-Sheikh A， Fan R， Birks D， et al. Inhibition of Aurora Kinase A Enhances Chemosensitivity of Medulloblastoma Cell Lines. Pediatr Blood Cancer，2010，55（1）：35～41.

11Sakaku ra C， H agiw ara A， Yas uoka R， et al. Tumou r-amplif iedkinaseBTAK is amplified and overex pressed in gastric cancers with possible involvement in aneu ploid formati on. Br J Cancer， 2001，84（6）： 824～831.

12Warner S L， Munoz R M， Stafford P， et al. Comparing Aurora-A and Aurora- B as molecular target s for growth in hibition of pancreatic cancer cells. Mol Cancer Ther， 2006， 5 （10） ：2450～2458.

13Zou Z， Yuan Z， Zhang Q， et al. Aurora kinase A inhibition-induced autophagy triggers drug resistance in breast cancer cells. Autophagy. 2012，8（12）：1798～1810.

14Hamidi T， Cano CE， Grasso D， et al. Nupr1-aurora kinase A pathway provides protection against metabolic stress-mediated autophagicassociated cell death. Clin Cancer Res. 2012，18（19）：5234～5246.

Objective To assess the relationship of Aurora-A expression with gemcitabine-resistance of pancreatic cancer. Methods The expression of Aurora-A mRNA of PANC-1 and PANC-1/R2 cells were tested by qPCR technique. The animal models of pancreatic cancer were estblised by PANC-1 and PANC-1/R2 cells. After 35days，mice were killed，and the tumor tissues were collected. The Aurora-A protein expression of the two groups were deteched by Immunohistochemistry. Results In the PANC-1 group，the metastasis of tumor on the fi ve weeks was 36.8% （7/19），the mean weight of tumor tissues was 0.453±0.110 g，and weight of mice was 23.2±1.41 g. While the metastasis of tumor on the fi ve weeks was 50%（9/18），the mean weight of tumor tissues was 0.564±0.203g，and weight of mice was 22.91±1.13g in PANC-1/R2 group. The metastatic rate and weight of tumor were with signifi cant differences （P＜0.05）. The expression of Aurora-A mRNA of PANC-1 cells was 1.002±0.040；while it was 1.845±0.069 in PANC-1/R2，it was signifi cant difference between the two groups （P＜0.05）. A 15 of 18 cases positive expression of Aurora-A protein were detected in PANC-1/R2 group，while it was 11 of 19 cases in PANC-1 group. The signifi cant difference was found between the two groups（P＜0.05）. Conclusions High expression of Aurora-A gene is associated with gemcitabine- resistance of pancreatic cancer cell lines. PANC-1/R2 cell was successful as a cell model of gemcitabine-resistance of pancreatic cancer.

Aurora-A kinase Pancreatic carcinoma Multiple drug resistance Gemcitabine

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃（2012KYB018）；浙江省中醫(yī)藥優(yōu)秀青年人才基金（2013ZQ022）

321013 浙江省金華文榮醫(yī)院普外科（何永禮 施福田）321061浙江省金華市人民醫(yī)院普外科（嚴(yán)秋亮）310009 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科（朱錦輝）310011浙江省消防總隊(duì)醫(yī)院（王欣）