滕菲，肖華，王寧鶴，李玉，路福平

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

蔗糖異構(gòu)酶突變菌株的構(gòu)建及其應(yīng)用研究

滕菲，肖華，王寧鶴，李玉，路福平

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

蔗糖異構(gòu)酶是糖苷水解酶13家族的重要成員，可以異構(gòu)化蔗糖生成異麥芽酮糖和海藻酮糖，同時水解生成少量的葡萄糖和果糖。通過定點突變法對土壤發(fā)散菌來源的蔗糖異構(gòu)酶基因進行定點突變，在大腸桿菌中實現(xiàn)異源表達，獲得3例突變菌株R-M1（Q299E），R-M2（Q299D），R-M3（Q299N）。R-M1轉(zhuǎn)化蔗糖的產(chǎn)物當(dāng)中，異麥芽酮糖的比例從90.28%升至93.16%，海藻酮糖比例從3.09%降低到1.79%。對突變菌株R-M1游離細胞轉(zhuǎn)化蔗糖底物的條件進行了優(yōu)化，確定了最適轉(zhuǎn)化條件為：30℃條件下，投入濃度為8×109cfu/mL的細胞到蔗糖濃度為50%的10 mL的磷酸檸檬酸緩沖液中，反應(yīng)90 min，可實現(xiàn)蔗糖最大程度的轉(zhuǎn)化，麥芽酮糖產(chǎn)物濃度達到460 mg/mL。

蔗糖異構(gòu)酶；土壤發(fā)散菌；異麥芽酮糖；全細胞轉(zhuǎn)化

蔗糖異構(gòu)酶（sucroseisomerase，SIase，EC5.4.99.11）是一類重要的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，主要有兩種作用，一是異構(gòu)化，可以催化蔗糖異構(gòu)化反應(yīng)生成異麥芽酮糖（α-D-吡喃葡糖基-1，6-D-果糖，isomaltulose）和海藻酮糖（α-D-吡喃葡糖基-1，1-D-果糖，trehalulose）兩種主要產(chǎn)物；二是水解，異構(gòu)化的同時水解蔗糖生成少量的葡萄糖和果糖。

SIase以蔗糖為底物，可生成異麥芽酮糖，異麥芽酮糖除具有與蔗糖類似的物理性質(zhì)和口感外，還有低熱量、不致齲、不吸濕、耐酸解等特點，因此在無糖甜食品的生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景［1-2］。不同微生物來源的SIase作用于蔗糖所形成的產(chǎn)物比例各不相同，尤其是異麥芽酮糖和海藻酮糖的比例差別較大，如紅色精朊桿菌、普城沙雷氏菌、大黃歐文氏菌、植生克雷伯氏菌、克雷伯氏菌LX3和分散泛菌UQ68J轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)物主要是異麥芽酮糖（75%～91%）［4-9］；而嗜溫嗜酸假單胞菌MX-45和放射形土壤桿菌MX-232轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)物為海藻酮糖（88%～90%）［10-11］。

據(jù)報道，不同來源的SIase中，土壤發(fā)散菌UQ68J來源的SIase催化蔗糖獲得異麥芽酮糖產(chǎn)物的比例最高。本實驗室已構(gòu)建了土壤發(fā)散菌來源的SIase在大腸桿菌中表達的重組菌R-W（BL21/pET22b-sim），在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過對蔗糖異構(gòu)酶基因進行定點突變，構(gòu)建重組突變株，并對催化產(chǎn)物中異麥芽酮糖比例較高的突變株的轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化，為開發(fā)細胞催化或酶法催化生產(chǎn)異麥芽酮糖的工業(yè)應(yīng)用提供理論參考。

1材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌重組菌R-W：天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院實驗室構(gòu)建和保存。

1.2試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶SacI、BamHI、T4DNA連接酶、PCR試劑、DNA marker、DNA片段純化試劑盒：均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA抽提試劑盒和質(zhì)?？焖俪樘嵩噭┖校壕徸陨虾Ｉ昴懿┎士萍加邢薰荆籌PTG、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品：購自美國Bio RAD公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純；異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma公司。

1.3方法

1.3.1突變菌株的構(gòu)建

1.3.1.1定點突變引物的設(shè)計

根據(jù)質(zhì)粒pET22b-sim的基因序列，和突變位點Q299E，Q299D，Q299N的選擇，利用Primer5.0設(shè)計出全長擴增引物sim-f、sim-p，重疊引物mid-f1、mid-p1；midf2、mid-p2；mid-f3、mid-p3，如表1所示。

表1　引物序列表Table 1The table of primer sequence

1.3.1.2重疊PCR擴增突變基因及重組突變株的構(gòu)建

早期構(gòu)建的重組菌R-W，實現(xiàn)了SIase在大腸桿菌的可溶性表達。本研究以重組表達質(zhì)粒pET22b-sim為模板，通過定點突變得到突變基因sim1（Q299E），sim2（Q299D），sim3（Q299N），分別克隆于pET-22b表達載體，轉(zhuǎn)入E.coli BL21表達宿主，獲得重組菌R-M1（Q299E），R-M2（Q299D），R-M3（Q299N）。

1.3.2突變重組菌的培養(yǎng)及重組酶的誘導(dǎo)表達

LB培養(yǎng)配方參考文獻［12］；菌體生長量以O(shè)D600值表示。挑取重組菌接種于2 mL含100 mg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/mim培養(yǎng)過夜。取1 mL培養(yǎng)物接種于裝有50 mL LB（Amp）液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃，200 r/mim培養(yǎng)，直到OD600=0.6～0.8，加入0.5 mmol/L的IPTG，于20℃下誘導(dǎo)10h，誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌體細胞，于6 000 r/min，4℃離心20 min，去除上清，將菌體細胞用緩沖液洗滌重懸。

1.3.3重組酶活力的測定

取經(jīng)誘導(dǎo)表達后的細胞培養(yǎng)液1 mL，6 000 r/min離心10 min收集菌體，使用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液洗滌3次，后重懸至1 mL，加入30℃下預(yù)熱的，體積為5 mL的10%蔗糖濃度的pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液作為底物，在30℃的恒溫槽中反應(yīng)10 min，后沸水浴5 min終止酶促反應(yīng)，12 000 r/min離心10 min取上清液，同樣的方法應(yīng)用于不含目的基因的大腸桿菌制備空白對照。各取5 mL于50 mL比色管中稀釋10倍；各取1 mL稀釋液加入0.5 mL DNS溶液，混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫后加入4 mL蒸餾水；以空白樣品作參比，用1 cm比色皿在540 nm測定吸光值；以烘干恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物代替酶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖（還原糖）濃度，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所測粗酶液轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)生還原糖的含量，從而測定SIase的酶活。

酶活力的定義為：1 mL酶液或1 g酶粉在30℃，pH 6.0的條件下，1 min催化可形成相當(dāng)于1 μmol葡萄糖的還原糖，即為一個酶活力單位，符號為：1 kat/mL或1 kat/g［13］。

1.3.4重組突變株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中異麥芽酮糖的分析檢測

取經(jīng)誘導(dǎo)表達后的細胞培養(yǎng)液5 mL，6 000 r/min離心10 min收集菌體，使用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液洗滌3次，后重懸至1 mL，在50 mL離心管中加入10 mL，10%蔗糖濃度的pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液，放入30℃的恒溫槽中預(yù)熱5 min，加入1 mL菌體重懸液，搖勻，恒溫槽中反應(yīng)60 min，反應(yīng)液經(jīng)離心過膜處理，作為HPLC樣品，用于檢測各糖組分濃度。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC檢測條件如下，檢測器：RID示差檢測器；色譜柱：TSK-gel分析柱；流動相：乙腈∶水= 90∶10（體積比）；柱溫：80℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3.5重組菌R-M1（Q299E）合成異麥芽酮糖的條件研究

1.3.5.1細胞濃度對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響

取經(jīng)誘導(dǎo)表達后的細胞培養(yǎng)液于4℃，6 000 r/min離心10 min獲得菌體細胞，用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液將細胞洗滌3次，以不同的菌體濃度（1×109、2× 109、4×109、6×109、8×109、1×1010cfu/mL）添加到轉(zhuǎn)化液中，用于轉(zhuǎn)化10 mL質(zhì)量分數(shù)為60%蔗糖溶液，考察細胞用量對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響。

1.3.5.2溫度對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響

取經(jīng)誘導(dǎo)表達后的細胞培養(yǎng)液于4℃，6 000 r/min離心10 min獲得菌體細胞，用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液將細胞洗滌3次，以約為8×109cfu/mL的菌體濃度投入到轉(zhuǎn)化液中，在溫度分別為30、35、40℃的條件下，用于轉(zhuǎn)化10 mL質(zhì)量分數(shù)為60%蔗糖溶液，考察溫度對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響。

1.3.5.3蔗糖質(zhì)量分數(shù)對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響

取經(jīng)誘導(dǎo)表達后的細胞培養(yǎng)液于4℃，6 000 r/min離心10 min獲得菌體細胞，用pH 6.0的檸檬酸磷酸鹽緩沖液將細胞洗滌3次，以約為8×109cfu/mL的菌體濃度，在30℃條件下，添加入不同蔗糖濃度的溶液中（40%、50%、60%、70%）進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，考察蔗糖質(zhì)量分數(shù)對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響。

2結(jié)果分析

2.1突變菌株的構(gòu)建

2.1.1Gln299突變?yōu)镚lu獲得sim1

以質(zhì)粒pET22b-sim為模板，分別以引物sim-f和重疊引物mid-p1，重疊引物mid-f1和引物sim-p進行PCR，得到PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2。結(jié)果見圖1。

圖1　重疊PCR產(chǎn)物結(jié)果檢測圖譜Fig.1Agarose gel electrophoresis of recombinant PCR

電泳條帶顯示一條約900 bp和一條約800 bp的條帶分別與產(chǎn)物1和產(chǎn)物2預(yù)期大小相當(dāng)。結(jié)果如圖1-A所示。然后經(jīng)過重疊PCR及大量擴增PCR，將PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2進行重組，得到一條全長約1700 bp的條帶，與目的基因sim1大小相符。結(jié)果如圖1-B所示。

2.1.2Gln299突變?yōu)锳sp獲得sim2，Gln299突變?yōu)锳sn獲得sim3

方法同2.1.1。

2.1.3突變菌株R-M1，R-M2，R-M3的鑒定

SacI和BamHI雙酶切，回收sim1，sim2，sim3片段，將其與經(jīng)相同酶切線性化的pET-22b（+）載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli DH5α，提取轉(zhuǎn)化子酶切驗證，獲得大小約為1 700 bp和5 500 bp大小的片段，結(jié)果正確，如圖2所示。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入載體E.coli BL21，獲得突變菌株R-M1，R-M2，R-M3。

2.2HPLC定量分析異麥芽酮糖

圖2　雙酶切鑒定重組質(zhì)粒Fig.2Identification of recombinant plasmid by digestion with SacI and BamHI

圖3　HPLC法對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析檢測圖譜Fig.3HPLC analysis of the sugars converted by SIase

異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)品及反應(yīng)樣品的HPLC結(jié)果如圖3所示（A、B），從色譜圖中可以看出，異麥芽酮糖出峰時間為60.375 min，果糖12.393 min，葡萄糖18.676 min，蔗糖49.582 min，海藻酮糖67.829 min。果糖、葡萄糖、蔗糖、異麥芽酮糖、海藻酮糖5者能夠完全分開，且峰形較好。反應(yīng)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品樣品圖譜相比，兩個主峰形狀相似，保留時間一致，該HPLC方法可以對異麥芽酮糖進行有效、同步的定量分析。

2.3突變菌株R-M1，R-M2，R-M3的重組酶活力及催化產(chǎn)物分析

經(jīng)酶活力檢測及HPLC法對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中各糖組分含量的測定，結(jié)果如表2所示。

與R-W菌株相比，3株突變株的酶活力均沒有顯著的變化。而在產(chǎn)物特異性方面，只有R-M1的異麥芽酮糖比例有一定的升高，從野生型的異麥芽酮糖占90.28%升至93.16%，海藻酮糖比例從3.09%下降至1.79%，同時水解作用也有些微的降低。因此，對Q299E突變體轉(zhuǎn)化蔗糖的反應(yīng)條件進行進一步的優(yōu)化，提高轉(zhuǎn)化效率，為大規(guī)模高效生產(chǎn)異麥芽酮糖提供可能。

表2　異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中糖組分的分析Table 2Sugar compositions of reaction mixtures of the enzymes

2.4突變菌株R-M1合成異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化條件研究

2.4.1細胞濃度對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響

考察細胞濃度對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響見圖4。

圖4　細胞用量對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響Fig.4Effects of the amount of cells on isomaltulose production

由圖4可見：誘導(dǎo)結(jié)束后，將培養(yǎng)基離心獲得菌體細胞，緩沖液洗滌3次，以不同的菌體濃度（1×109、2×109、4×109、6×109、8×109、1×1010cfu/mL）添加到轉(zhuǎn)化液中，細胞濃度高異麥芽酮糖生成速率快，但細胞濃度高于8×109cfu/mL時，異麥芽酮糖生成速率變化不大，均能在120 min內(nèi)轉(zhuǎn)化完全，最終異麥芽酮糖的濃度達到557 mg/mL。因此選擇濃度為8×109cfu/mL的細胞用于轉(zhuǎn)化10 mL濃度為60%的蔗糖溶液。

2.4.2溫度對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響

溫度對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響見圖5。

由圖5可見：在溫度為30、35、40℃時，異麥芽酮糖的生成曲線很相似，反應(yīng)120 min后，異麥芽酮糖產(chǎn)量均不再升高，其中在30℃條件下，異麥芽酮糖的生成速率相對略快，120 min后達到555 mg/mL，而轉(zhuǎn)化溫度為25℃時，反應(yīng)120min后異麥芽酮糖僅能達到465 mg/mL。因此選30℃作為最佳轉(zhuǎn)化溫度。

圖5　轉(zhuǎn)化溫度對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響Fig.5Effects of the temperature on isomaltulose production

2.4.3蔗糖質(zhì)量分數(shù)對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響

蔗糖質(zhì)量分數(shù)對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響見圖6。

圖6　底物濃度對異麥芽酮糖產(chǎn)量的影響Fig.6Effects of substrate concentration on isomaltulose production

由圖6可見：底物質(zhì)量分數(shù)越小，完全轉(zhuǎn)化所需的時間越短。當(dāng)蔗糖質(zhì)量分數(shù)分別為40%和50%時，90 min內(nèi)均能完全轉(zhuǎn)化，異麥芽酮糖濃度達到370 mg/mL和460 mg/mL，隨著底物濃度的增大，糖溶液黏度也增大，轉(zhuǎn)化速率降低，當(dāng)蔗糖質(zhì)量分數(shù)增加至60%或70%時，120 min時轉(zhuǎn)化仍沒有實現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，此時異麥芽酮糖濃度分別達到496 mg/mL和521 mg/mL。實驗操作過程中發(fā)現(xiàn)，底物濃度越大，糖溶液黏度增大不利于產(chǎn)物的提取分離。綜合考慮，盡可能在較短的時間內(nèi)使底物轉(zhuǎn)化完全及產(chǎn)物后期提取的可操作性，選擇50%蔗糖溶液作為催化底物。

3結(jié)論

1）本文通過定點突變法對已構(gòu)建的重組菌R-W的蔗糖異構(gòu)酶基因進行分子改造，獲得突變菌株RM1，R-M2，R-M3。其中R-M1與原始基因表達菌株相比產(chǎn)物特異性發(fā)生明顯變化，異麥芽酮糖的比例從90.28%升至93.16%，海藻酮糖比例從3.09%降低到1.79%。

2）確定了R-M1的最適轉(zhuǎn)化條件為：30℃條件下，投入細胞濃度為8×109cfu/mL的細胞到蔗糖濃度為50%的10 mL溶液中，反應(yīng)90 min，可實現(xiàn)蔗糖99%以上的最大程度的轉(zhuǎn)化，獲得異麥芽酮糖產(chǎn)物濃度達到460 mg/mL。

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Engineering of Mutant Sucrose Isomerase Producing Strain and Its Application

TENG Fei，XIAO Hua，WANG Ning-he，LI Yu，LU Fu-ping
（The College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

Sucrose isomerase was a major member in the glucoside hydrolase family 13.In addition to catalyzing the isomerization of sucrose to isomaltulose，it also produced trehaltulose and small amounts of fructose and glucose.Sim derived from Pantoea dispersa had been subject to site-directed mutagenesis；3 mutants（RM1（Q299E），R-M2（Q299D），R-M3（Q299N））were obtained.Q299E exhibited increased isomaltulose content（from 90.28%to 93.16%）and reduced percentage of trehalulose（from 3.09%to 1.79%）.The optimal conditions for sucrose conversion of mutant R-M1 was determined as follows：the culture（substrate concentration was 8×109cfu/mL）was centrifuged and then resuspended in 10 mL of citrate/phosphate-buffered 50%sucrose solutionand incubated for 90 min at 30℃.Sucrose was completely converted under the above conditions and the concentrations of isomaltulose reached up to 460 mg/mL.

sucrose isomerase；Pantoea dispersa；isomaltulose；whole-cell biotransformation

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.036

2014-05-20

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目“糖醇合成與功能性糖醇的研制”（2012AA021502）；教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目“食品安全與營養(yǎng)關(guān)鍵控制技術(shù)研究”（IRT1166）

滕菲（1989—），女（漢），碩士，研究方向：微生物與分子生物學(xué)。