王緒英，王婉婷

（六盤水師范學(xué)院生命科學(xué)系，貴州六盤水553004）

茶多酚與類胡蘿卜素的協(xié)同抗氧化作用

王緒英，王婉婷

（六盤水師范學(xué)院生命科學(xué)系，貴州六盤水553004）

采用DPPH和羥自由基（·OH）體系的清除試驗(yàn)，比較茶多酚與類胡蘿卜素單獨(dú)和復(fù)配后的抗氧化活性。結(jié)果顯示：在羥自由基（·OH）體系中兩者的協(xié)同抗氧化能力更為顯著，當(dāng)茶多酚濃度稀釋一倍或兩倍時(shí)，隨類胡蘿卜素濃度的升高，兩者的混合物對(duì)羥自由基（·OH）的清除率也逐漸升高。在DPPH自由基體系中，當(dāng)茶多酚濃度稀釋一倍或兩倍時(shí)，隨類胡蘿卜素濃度的升高，兩者的混合物對(duì)DPPH自由基的清除率先升高后降低。

茶多酚；類胡蘿卜素：協(xié)同抗氧化作用

茶葉是中華民族傳統(tǒng)的保健飲品，茶葉具有優(yōu)異的減輕自由基損傷、抗氧化性、降低血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病等多種生物學(xué)功效［1］。

茶葉中的有機(jī)成分，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為花青素類、酚酸及縮酚酸類、黃酮及黃酮醇類、兒茶素類4類，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，生產(chǎn)延緩衰老、抗病毒、抗菌、抗癌和降血脂的各種藥品中［2］。其中兒茶素類中主要功效成分是茶多酚，抗氧能力強(qiáng)于常見的VC和VE等［3］。茶多酚（C17H19N3O）是一種稠環(huán)芳香烴，為白色無定形粉末，在潮濕空氣中易被氧化成棕色?？扇苡谒图状肌⒁掖?、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，微溶于油脂，在中性和酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下易氧化聚合［4］。茶多酚的抗氧化作用是由于兒茶素C環(huán)和B環(huán)上的酚羥基有供氫體的活性，在氧化過程中生成鄰醌類及聯(lián)苯酚醌。它可以有效清除脂類自由基和氧自由基，近代醫(yī)學(xué)研究表明，茶多酚具有抗癌、抗衰老、抗輻射、清除人體自由基、降低血糖血脂等一系列重要的藥理功能［5］，在油脂、食品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。研究表明，抗氧化劑的協(xié)同作用規(guī)律對(duì)茶多酚也是適用的，不僅茶多酚單體之間存在協(xié)同作用，茶多酚與其他抗氧化劑也有協(xié)同效應(yīng)［6］。關(guān)于類胡蘿卜素與其它物質(zhì)所表現(xiàn)出的協(xié)同抗氧化性一直缺乏相關(guān)研究。本研究以產(chǎn)自貴州省典型的喀斯特地貌地區(qū)六盤水的“水城春”茶葉為研究對(duì)象，主要探討茶多酚與類胡蘿卜素的協(xié)同抗氧化性，為茶葉的復(fù)合保健品的開發(fā)與應(yīng)用提供一些有用的參數(shù)。

1材料與方法

1.1主要儀器

電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；恒溫干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HH-60超級(jí)恒溫水浴鍋：金壇市恒豐儀器廠；722可見分光光度計(jì)：上海箐華科技儀器有限公司；SHB-3循環(huán)水多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠。

1.2主要試劑

三氯甲烷，乙醇，焦性沒食子酸，酒石酸亞鐵溶液，pH7.5磷酸緩沖液，石英砂，甲醇，二苯代苦味酰自由基（DPPH），硫酸亞鐵，過氧化氫，水楊酸。

1.3方法

1.3.1茶多酚的提?。?］

稱取茶葉粉末10 g，置于200 mL錐形瓶，加入萃取劑乙醇，于60℃水浴中浸提30 min后，用紗布過濾，收集濾液。再向?yàn)V液中加入等量的萃取液，水浴濃縮至70 mL左右，最后用1倍體積的三氯甲烷萃取茶多酚3次。收集上層萃取液，待用。

1.3.2茶多酚的含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確移取不同濃度的焦性沒食子酸溶液分別置于10 mm比色管，用蒸餾水定容至1 mL，加入0.5 mL酒石酸亞鐵，充分搖勻，再加入1.5 mL pH 7.5磷酸緩沖液混勻，靜置10 min后，置于540 nm處測定吸光度值，以蒸餾水替代焦性沒食子酸溶液為空白對(duì)照，以焦性沒食子酸溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品液中茶多酚含量測定：移取1 mL樣品液置于10 mm比色管中，加入0.5 mL酒石酸亞鐵，充分混合，再加入1.5 mL磷酸緩沖液，混勻，靜置10 min，同時(shí)以蒸餾水替代樣品液為空白對(duì)照。于540 nm處測定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其茶多酚含量。

1.3.3類胡蘿卜素的提取

將新鮮胡蘿卜搗碎，紗布擠汁后，用移液管吸取20 mL樣液置于50 mL燒杯中，在燒杯中加入3 g石英砂用布氏漏斗過濾（紙上鋪有2 g石英砂），然后再用5 mL水沖洗濾渣3次。在250 mL的分液漏斗中倒入濾液，再加入20 mL 1/2（體積比）氯仿-甲醇的萃取劑，振搖后靜置，收集下部分有機(jī)相，再用20 mL萃取劑提取兩次，將萃取有機(jī)相合并，用萃取劑定容為100 mL。待用（由于類胡蘿卜素的不穩(wěn)定性，操作均避光進(jìn)行）。

1.3.4類胡蘿卜素的含量測定

移取3 mL類胡蘿卜素樣液在（440±10）nm波長下測定提取液的最大吸光度A。以萃取劑作為空白對(duì)照。用公式（1）計(jì)算（類胡蘿卜素總量用mg/L表示）：

式中：A為測定的最大吸光度；20為換算系數(shù)。

1.3.5茶多酚與類胡蘿卜素的抗氧化作用［8］

1.3.5.1茶多酚與類胡蘿卜素分別對(duì)DPPH自由基的清除

移取1 mL樣品液采用10倍稀釋法稀釋成100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8濃度的樣品液，再分別取0.5 mL稀釋液，用蒸餾水配成1 mL的樣品液（類胡蘿卜素樣品液直接取1 mL）與2 mL 120 μmol/L的DPPH溶液加入同一支試管中，搖勻，在黑暗中放置30 min，以三氯甲烷替代樣品液為空白對(duì)照，在517 nm波長處測定其吸光度Ai。用公式（2）計(jì)算清除率。

式中：Ac為1 mL三氯甲烷加2 mL 120 μmol/L的DPPH溶液的吸光度值；Ai為1 mL待測液加2 mL 120 μmol/L的DPPH溶液的吸光度值。

1.3.5.2茶多酚與類胡蘿卜素分別對(duì)羥自由基（·OH）的清除［9］

反應(yīng)體系：試管中依次加入1mL2mmol/L的FeSO4，1 mL 6 mmol/L的過氧化氫，搖勻后加入3 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇，于37℃水浴中保溫15 min后取出，以蒸餾水為參比，在510 nm波長處測定其吸光度值A(chǔ)0，然后加入0.4 mL被稀釋的茶多酚樣品液（類胡蘿卜素樣品液取0.4 mL），搖勻，于37℃水浴中保溫15 min后取出，在510 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)X?？紤]到色素本身的吸光度值，以1 mL 2 mmol/L的FeSO4，1 mL 6 mmol/L的蒸餾水，3 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇，再加樣品液作為色素的本底吸收，在510 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)x0。用公式（3）計(jì)算抑制率。

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度值；AX為混合物樣品液的吸光度值；Ax0為混合物樣品液中色素的吸光度值。

1.3.6茶多酚與類胡蘿卜素協(xié)同抗氧化作用

1.3.6.1茶多酚與類胡蘿卜素對(duì)DPPH自由基的協(xié)同清除作用

選取稀釋10倍和100倍的茶多酚為樣品液1、2號(hào)。準(zhǔn)確移取1 mL樣品液1號(hào)置于試管中，加入不同濃度梯度的類胡蘿卜素1 mL，再加入2 mL 120 μmol/L的DPPH溶液加入同一支試管中，搖勻，在黑暗中放置30 min，以三氯甲烷代替樣品液為空白對(duì)照，在517 nm波長處測定其吸光度Ai。用公式（2）計(jì)算清除率。（樣品液2號(hào)試驗(yàn)操作同樣品液1號(hào)）。

1.3.6.2茶多酚與類胡蘿卜素對(duì)羥自由基（·OH）的協(xié)同清除作用

選取稀釋10倍和100倍的茶多酚為樣品液1、2號(hào)。準(zhǔn)確移取0.4 mL樣品液1號(hào)置于試管中，加入不同濃度梯度的類胡蘿卜素0.4 mL。在羥自由基（·OH）反應(yīng)體系中測定510 nm波長處的吸光度值A(chǔ)。用公式（3）計(jì)算清除率。（樣品液2號(hào)實(shí)驗(yàn)操作同樣品液1號(hào)）。

2結(jié)論

2.1茶多酚的含量

2.1.1焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

按方法項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，用最小二乘法經(jīng)線性回歸，得茶多酚濃度與吸光度的回歸方程（4）。

2.1.2茶多酚的含量

移取1 mL茶多酚樣品液按方法項(xiàng)下測其吸光度值，代入焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（4）中計(jì)算，得茶多酚濃縮液的質(zhì)量濃度為C=208 μg/mL。

2.2類胡蘿卜素的含量

移取3 mL類胡蘿卜素樣液按方法項(xiàng)下測其吸光度值，根據(jù)公式（1）計(jì)算得類胡蘿卜素的濃度為C= 14.26 μg/mL。

2.3茶多酚與類胡蘿卜素的抗氧化作用

茶多酚與類胡蘿卜素的抗氧化作用見表1。

表1　茶多酚和類胡蘿卜素對(duì)DPPH與羥自由基（·OH）的清除作用Table 1The scavenging effect of tea polyphenol and caroteniods on oxygen free radical（DPPH and·OH）

表1可知，隨茶多酚和類胡蘿卜素濃度的升高，它們對(duì)DPPH自由基的清除作用也逐漸升高。其濃度與對(duì)DPPH自由基清除作用呈正相關(guān)。隨茶多酚和類胡蘿卜素濃度的升高，它們對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用也逐漸升高。其濃度與對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用也呈正相關(guān)。

2.4茶多酚與類胡蘿卜素協(xié)同抗氧化作用結(jié)果

茶多酚與類胡蘿卜素協(xié)同抗氧化作用結(jié)果見表2。

表2　茶多酚和類胡蘿卜素對(duì)DPPH自由基及羥自由基（·OH）的協(xié)同清除作用Table 2The synergistic antioxidative activity of tea polyphenol and caroteniods on oxygen free radical（DPPH and·OH）

由表2可見，當(dāng)茶多酚濃度為20.8 μg/mL時(shí)，茶多酚和類胡蘿卜素的混合物對(duì)DPPH的協(xié)同清除作用是隨類胡蘿卜素的濃度增加而增加，當(dāng)類胡蘿卜素濃度增加0.142 6×10-2μg/mL時(shí)，混合物對(duì)DPPH的協(xié)同清除作用達(dá)到最大值，這時(shí)再增加類胡蘿卜素的濃度，混合物對(duì)DPPH的協(xié)同清除作用不再增加。但沒有此濃度下的茶多酚單獨(dú)作用時(shí)的能力強(qiáng)。

當(dāng)茶多酚濃度為濃度為2.08 μg/mL時(shí)，茶多酚和類胡蘿卜素的混合物對(duì)DPPH的協(xié)同清除作用是隨類胡蘿卜素的濃度增加而增加，當(dāng)類胡蘿卜素濃度增加到0.142 6×10-1μg/mL時(shí)，混合物對(duì)DPPH的協(xié)同清除作用達(dá)到最大值，這時(shí)再增加類胡蘿卜素的濃度，混合物對(duì)DPPH的協(xié)同清除作用不再增加，并大于此濃度下的茶多酚單獨(dú)作用時(shí)的能力。稀釋二倍濃度的茶多酚與不同濃度的類胡蘿卜素的混合物對(duì)DPPH自由基的協(xié)同清除作用較強(qiáng)。

茶多酚與類胡蘿卜素對(duì)羥自由基（·OH）的協(xié)同清除作用如表2所示，2個(gè)不同濃度的茶多酚與類胡蘿卜素對(duì)羥自由基（·OH）的協(xié)同抗氧化作用，在類胡蘿卜素濃素較高時(shí)，稀釋二倍濃度的茶多酚與類胡蘿卜素的協(xié)同作用相對(duì)較強(qiáng)。當(dāng)茶多酚濃度稀釋一倍的溶度時(shí)，茶多酚與類胡蘿卜素清除羥自由基（·OH）能力在類胡蘿卜素溶度為14.26 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，并大于此濃度下的茶多酚單獨(dú)作用時(shí)的能力強(qiáng)；當(dāng)茶多酚濃度為稀釋二倍的溶度時(shí)，茶多酚與類胡蘿卜素清除羥自由基（·OH）能力在類胡蘿卜素濃度為14.26 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，并大于此濃度下的茶多酚單獨(dú)作用時(shí)的能力。

3討論

茶多酚可以封閉催化氧化反應(yīng)的金屬離子和引起氧化反應(yīng)的物質(zhì)，從而延長氧化的誘導(dǎo)期，減慢反應(yīng)速度［10］，其抗氧化性與其各組分之間的組合比例有密切關(guān)系，各組分之間存在協(xié)同抗氧化作用［11］，茶多酚和類胡蘿卜素都有較強(qiáng)抗氧化的能力［12-14］。許多研究表明，多種抗氧化劑聯(lián)合作用，其抗氧能力往往要大于使用同劑量的單一抗氧化劑的效果，所以抗氧化劑之間具有協(xié)同作用，其機(jī)理主要包括絡(luò)合金屬離子、修復(fù)再生、吸收氧氣、改變酶的活性、偶聯(lián)氧化等［15］。類胡蘿卜素是VA的前體，有獨(dú)特的生理功能，茶多酚能夠保護(hù)β-胡蘿卜素（β-胡蘿卜素?zé)o抗氧化性，且有輕度助氧化作用），通過提高其保存率來發(fā)揮協(xié)同作用，最終達(dá)到增強(qiáng)抗氧化效果［12，16］。本試驗(yàn)采用DPPH自由基清除試驗(yàn)和羥自由基（·OH）清除試驗(yàn)測定茶多酚與類胡蘿卜素的協(xié)同抗氧化的能力，試驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚與類胡蘿卜素在這2個(gè)體系下都具有協(xié)同抗氧化的能力，但隨類胡蘿卜素濃度的升高，2個(gè)體系中自由基的清除率變化有所不同。當(dāng)茶多酚濃度稀釋一倍的溶度時(shí)，茶多酚與類胡蘿卜素清除羥自由基（·OH）能力在類胡蘿卜素溶度為14.26 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，并大于此濃度下的茶多酚單獨(dú)作用時(shí)的能力強(qiáng)；當(dāng)茶多酚濃度為稀釋二倍的溶度時(shí)，茶多酚與類胡蘿卜素清除羥自由基（·OH）能力在類胡蘿卜素濃度為14.26 μg/ mL時(shí)達(dá)到最大值，并大于此濃度下的茶多酚單獨(dú)作用時(shí)的能力。

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Synergistic Antioxidative Activity of Tea Polyphenols and Caroteniods

WANG Xu-ying，WANG Wan-ting
（Department of Life Science，Liupanshui Normal College，Liupanshui 553004，Guizhou，China）

Use scavenging experiment of the system that were made up of DPPH radical and hydroxyl radical（·OH）to compare the antioxidant activity among the individual polyphenols and carotenoids and the compound of them.The result showed that：in the system of hydroxyl radical（·OH），the synergistic antioxidant capacity of both of them is more significant.When the concentration of polyphenols diluted double or triple and with the carotenoid concentration increasing，then the mixture of both hydroxyl radical（·OH）clearance rate also increased.In DPPH radical system，when the concentration of polyphenols diluted double or triples and with the carotenoid concentration increasing，then the mixture of both DPPH radical clearance rate raised first and educed later.

tea polyphenol；caroteniods；synergistic antioxidative activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.011

2015-02-25

六盤水市科技局基金項(xiàng)目“貴州西部民族藥用植物資源研究與利用市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（續(xù)建）”（52020-2014-1-05-02）；貴州省省級(jí)重點(diǎn)主持學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目“植物學(xué)”（黔學(xué)位合字ZDXK［2014］24號(hào)）

王緒英（1971—），女（漢），教授，碩士，從事生物化學(xué)及植物化學(xué)成分分析研究。