宋藝君　楊史軍　王　湘　張東星　馮麗莉　孫　燕　蔡大勇　王玥琦△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(咸陽712046)

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丹皮酚對(duì)二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌前病變的預(yù)防作用*

宋藝君▲楊史軍□王湘▲張東星▲馮麗莉▲孫燕▲蔡大勇□王玥琦△▲

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(咸陽712046)

目的：研究丹皮酚(Pae)對(duì)二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌前病變的預(yù)防作用，并探討其作用機(jī)制。方法：采用腹腔注射DEN誘發(fā)大鼠肝癌前病變模型。雄性wistar大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、模型組、丹皮酚組。造模給藥16周后處死大鼠，觀察各組大鼠一般狀況，進(jìn)行肝臟病理組織學(xué)檢查，檢測(cè)肝功能指標(biāo)ALT、AST、GST、TBIL，脂質(zhì)過氧化指標(biāo)LPO、SOD、INOS、GSH-PX。結(jié)果：病理組織學(xué)顯示，丹皮酚可以顯著降低肝細(xì)胞異型增生灶和異型增生結(jié)節(jié)數(shù)目；降低血清中異常升高的ALT、AST、TBIL、GST、INOS、LPO水平，升高血清中降低的SOD、GSH-PX水平。結(jié)論：丹皮酚對(duì)于大鼠肝癌前病變具有一定程度的預(yù)防保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與改善肝功能，提高抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。

肝癌前病變是指在慢性肝病中出現(xiàn)的肝細(xì)胞不典型增生、腺瘤樣增生、肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)、肝細(xì)胞小管狀化生和卵原細(xì)胞增生，其發(fā)展為肝癌的幾率高，尤其是肝硬化病灶中出現(xiàn)的異型增生病灶或結(jié)節(jié)和異型增生細(xì)胞[1]。對(duì)于肝癌前病變，西醫(yī)學(xué)主要采用肝移植、手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、消融術(shù)等,但是患者復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，且給患者造成一定的痛苦[2]。采用預(yù)防干預(yù)的辦法來延緩或阻斷肝癌前病變的發(fā)生，使之無法進(jìn)展成肝癌，可達(dá)到防病治病的目的。牡丹皮為毛茛科植物牡丹的根皮和蘿藦科植物徐長卿的全草，主產(chǎn)于陜西、山東、湖南、湖北等地。味苦、辛，性微寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血，活血化瘀的作用，用于熱入營血、溫毒發(fā)斑、夜熱早涼、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲傷痛、臃腫瘡毒等癥[3]。牡丹皮主要含有丹皮酚(Paeonol,Pae)等活性成分,具有抗腫瘤、抗菌、增強(qiáng)免疫力、降壓、促進(jìn)微循環(huán)等藥理作用[4-5]。本試驗(yàn)以二乙基亞硝胺(DEN)腹腔注射誘發(fā)肝癌前病變大鼠模型，研究丹皮酚對(duì)肝癌前病變的預(yù)防作用，觀察丹皮酚對(duì)大鼠肝癌前病變組織病理學(xué)的改善和肝功能指標(biāo)、過氧化指標(biāo)的影響，為丹皮酚的進(jìn)一步臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Wistar大鼠26只，雄性，體重(220±10)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號(hào)SCXK(京)2010-0013，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室有關(guān)規(guī)定。

1.2材料和儀器丹皮酚原料藥(廣西億康藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)101021)；二-乙基亞硝胺(DEN,美國Sigma公司,批號(hào)1000928405，密度0.95 g· mL-1)；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST) 試劑盒、總膽紅素(TBIL) 試劑盒、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST) 試劑盒、脂質(zhì)過氧化物酶(LPO)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD) 試劑盒、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(INOS)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX) 試劑盒(南京建成生物工程有限公司)；Multiskan MK3 酶標(biāo)儀(上海熱電儀器有限公司)；LG16-W型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(北京京立離心機(jī))；vortex-genie2漩渦混合器(北京卓信偉業(yè)科技有限公司)；JM-B型萬分之一電子天平(余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司)；44x3顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠)；FS/FAS5030石蠟切片機(jī)( 德國 LETIZ公司)

2　方　法

2.1大鼠肝癌前病變模型的建立及給藥參照文獻(xiàn)[6]，將26只大鼠按照體重均衡原則隨機(jī)分為對(duì)照組大鼠6只、模型組和丹皮酚組大鼠各10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，模型組和給藥組均以 0.5 mL/100 g的DEN腹腔注射,每周50 mg/kg，連續(xù)給藥16周；對(duì)照組給予等體積生理鹽水。同時(shí)給予丹皮酚進(jìn)行預(yù)防：用0.5%CMCNa溶解丹皮酚配制成混懸液，按194.4 mg/kg的劑量給大鼠灌胃給藥，每天1次，連續(xù)16周，對(duì)照組和模型組給予同體積生理鹽水。

2.2取材各組大鼠均按照安排時(shí)間和劑量的DEN(0.5 mL/100 g)腹腔注射,末次注射后84 h,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清保存于-80℃，統(tǒng)一切取肝臟右葉2x4x6 mm3組織塊，4% 多聚甲醛溶液固定 48 h，石蠟包埋，切片，同步烤片與脫蠟，梯度酒精水化，HE染色。病理評(píng)價(jià)肝病變的性質(zhì)和程度。

2.3生化指標(biāo)采用酶標(biāo)儀檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，測(cè)量指標(biāo)為ALT、AST、TBIL、GST、SOD、LPO、GSH-PX、iNOS。

3　結(jié)　果

3.1肝臟組織病理表現(xiàn)從HE染色可以看出，對(duì)照組：肝小葉和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常。以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，核圓，染色質(zhì)稀疏，核膜清晰。無顯著變性與壞死，無水腫、出血與浸潤。模型組：以肝細(xì)胞變性與增生為主要病變。水腫的肝細(xì)胞體積增大，部分肝小葉出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死。肝細(xì)胞異型性增生，細(xì)胞核體積大，染色深與形態(tài)怪異，匯管區(qū)可找到淋巴細(xì)胞浸潤和膽管增生。丹皮酚組：病變性質(zhì)與模型組相似，但是有緩解趨勢(shì)。增生細(xì)胞異型性變小，少見雙核細(xì)胞。匯管區(qū)有淋巴細(xì)胞浸潤和膽管增生。結(jié)果見圖1。

3.2生化指標(biāo)檢測(cè)

3.2.1 Pae對(duì)大鼠肝癌前病變肝功能的影響：與對(duì)照組比較，模型組ALT、AST、TB、GST異常升高，有極顯著性差異(P<0.01),與模型組比較，丹皮酚可減輕血清中異常升高的ALT、AST、TB、GST水平，有極顯著性差異(P<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果提示丹皮酚能明顯改善肝功能損傷，且對(duì)損傷肝細(xì)胞具有一定的修復(fù)能力，結(jié)果見表1。

表1　Pae對(duì)模型大鼠肝功能的保護(hù)作用±s)

注：t-test與對(duì)照組比較,△P<0.05, ▲P<0.01；與模型組比較, □P<0.05, ■P<0.01

3.2.2Pae對(duì)肝癌前病變大鼠脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的影響：與對(duì)照組比較，模型組大鼠GSH-PX、SOD明顯降低，有極顯著性差異(P<0.01),模型組大鼠INOS，LPO明顯升高，有極顯著性差異(P<0.01)；丹皮酚可明顯增加SOD，GSH-PX含量(P<0.01)，且降低血清中LPO，INOS的含量(P<0.01，P<0.05)。SOD和GSH-PX的變化提示丹皮酚可清除氧自由基，顯著提高機(jī)體的抗氧化能力；INOS和LPO的變化提示丹皮酚可減少脂質(zhì)過氧化物對(duì)肝細(xì)胞和組織的氧化性損傷，從而明顯改善體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平，結(jié)果見表2。

表2　Pae對(duì)模型大鼠脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用±s)

注：t-test與對(duì)照組比較,△P<0.05, ▲P<0.01；與模型組比較, □P<0.05, ■P<0.01

4　討　論

轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素的血清水平是肝功損傷的重要標(biāo)志，ALT水平的升高是因?yàn)镈EN引起的肝細(xì)胞損傷使酶外泄到細(xì)胞外，通常伴隨著AST水平的升高。在本文研究中，相對(duì)于模型組，丹皮酚組可以顯著地減少血清ALT、AST、GST 和 TBIL的水平，暗示了丹皮酚對(duì)于DEN引起的肝毒性具有潛力的保護(hù)作用。

脂質(zhì)過氧化是自由基引起細(xì)胞損傷的一個(gè)主要機(jī)制。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，DEN的攝入可形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA，MDA可以和各種微粒相互作用引起氧化應(yīng)激壓力，進(jìn)而促使癌癥的發(fā)生。在癌癥形成階段，LPO也會(huì)隨著DEN的攝入不斷升高，這一動(dòng)態(tài)作用可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致自由基的大量升高，從而破壞了細(xì)胞的抗氧化防御能力[7]。在本文研究中，模型組的LPO水平不斷升高，丹皮酚組降低了LPO水平，這可能是因?yàn)榈てし泳哂星宄杂苫哪芰Α?/p>

對(duì)于內(nèi)生的、外在的毒性化合物如化學(xué)致癌劑、活性氧引起的細(xì)胞損傷，抗氧化酶可以起到主要的預(yù)防作用[8]。SOD 和 GPx具有對(duì)活性氧的直接清除作用[9]，GPx的抗氧化能力比SOD更強(qiáng)，能夠?qū)Ω嗟倪^氧化物進(jìn)行清除[10-11]。SOD可以清除超氧陰離子自由基和有害的氧化劑[12],作為對(duì)付超氧自由基的第一道防線。這些抗氧化酶活動(dòng)的減少可能是由于DEN代謝過程中自由基的大量產(chǎn)生所導(dǎo)致[13]。本文研究中，模型組動(dòng)物存在抗氧化酶活動(dòng)的減少，可能是由于DEN代謝過程中不斷增加的活性氧的產(chǎn)生導(dǎo)致。丹皮酚組抗氧化酶活動(dòng)增加，這可能是因?yàn)榈てし訉?duì)自由基的清除作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹皮酚組的肝功指標(biāo)和脂質(zhì)過氧化指標(biāo)都有所改善，結(jié)合病理組織學(xué)觀察，說明丹皮酚在一定程度上對(duì)大鼠肝癌前病變能起到一定的預(yù)防保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能與改善肝功能、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高抗氧化能力有關(guān)。該研究結(jié)果對(duì)于促進(jìn)丹皮酚抗肝癌前病變作用機(jī)制的深入研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

[1] 謝晶日,任公平,李明等.中醫(yī)藥防治肝癌前病變機(jī)制研究概況[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008,5(8):25-26.

[2] Maluccio M, Covey A. Recent Progress in Understanding, Diagnosing, and Treating Hepatocellular Carcinoma[J].CA cancer J Clin.,2012,62(6):394-9.

[3] 國家藥典委員會(huì),中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010: 160-161．

[4] 胡云飛,徐國兵.牡丹皮及其主要成分丹皮酚的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 安徽醫(yī)藥,2014,18(4):589-592.

[5] 孫雯辛,永潔龍,凱 花,等. 丹皮酚納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率及載藥量的測(cè)定[J].陜西中醫(yī)，2014,35(2):226-228.

[6] 宋藝君,劉曉婷,馮麗莉，等.二乙基亞硝胺誘發(fā)肝癌前病變大鼠模型的建立[J].世界華人消化雜志,2012,20(27):2562-2569.

[7] Klaunig JE, Kamendulis LM. The role of oxidative stress in carcinogenesis[J]. Ann Rev Pharmacol Toxicol,2004,44:239-67.

[8] Ozen T, Korkmaz H. Modulatory effect of Urtica dioica L (Urticaceae) leaf extract on biotransformation of enzyme systems, antioxidant enzymes, LDH and lipid peroxidation in mice[J]. Phytomedicine,2003,10:405-15.

[9] Byung Pal YU. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species[J]. Physiol Rev,1994,14:139-62.

[10] H. GEDIK. Risk factors for drug resistant bacterial infections: Hospital based study[J]. African Journal of Microbiology Research,2012,6(6)：1190-1196.

[11] A.R. Al-Ajlan. Tobacco smoking vs. lipid profile and anthropometric measures: A cross-sectional study among students in the Riyadh College of Health Sciences[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology,2012,6(10) :717-723.

[12] Rajeshkumar NV, Kuttan R. Modulation of carcinogenic response and antioxidant enzymes of rats administered with 1,2-dimethylhydrazine by Picroliv[J]. Cancer Lett, 2003,191(2):137-43.

[13] Vásquez-Garzón VR, Arellanes-Robledo J, Garcáa-Román R, et al. Inhibition of reactive oxygen species and preneoplastic lesions by quercetin through an antioxidant defense mechanism[J].Free Radic Res,2009,43(2):128-37.

(收稿2015-05-27；修回2015-07-01)

R258.5

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.09.086

*北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目(2011-CXD-04)

▲北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(北京100029)

□中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所(北京100193)

主題詞肝腫瘤，實(shí)驗(yàn)性丹皮酚二乙基亞硝胺