楊俊超　文穎娟　王　超

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽712046)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

葛根復(fù)方對(duì)重癥肌無力大鼠IFN-γ和TGF-β1的影響*

楊俊超文穎娟△王超

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽712046)

目的:研究葛根復(fù)方對(duì)重癥肌無力大鼠干擾素γ(IFN-γ)和 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)影響，并探討其作用機(jī)制。方法:將80只lewis大鼠隨機(jī)分為4組，造模成功后分別給予陽性對(duì)照組(強(qiáng)的松)，葛根復(fù)方組連續(xù)灌胃治療4W給予藥物治療。結(jié)果:與空白組比較，造模組的IFN-γ表達(dá)水平顯著升高，與模型組比較，強(qiáng)的松組和中藥組大鼠的血清中IFN-γ含量明顯降低；治療后與強(qiáng)的松組比較，中藥組IFN-γ含量要偏低與空白組比較，造模組的TGF-β1表達(dá)水平顯著降低，與模型組比較，強(qiáng)的松組，中藥組大鼠的TGF-β1含量明顯升高；治療后與強(qiáng)的松組比較，中藥組TGF-β1含量要偏高。結(jié)論:葛根復(fù)方抑制了IFN-γ的含量，促進(jìn)俄TGF-β1含量升高。

重癥肌無力(MG)發(fā)病機(jī)制可能與多種因素相關(guān)，近來研究發(fā)現(xiàn)干擾素γ(IFN-γ)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1) 能干預(yù)MG的病理免疫反應(yīng)過程。本研究人使用人工合成的乙酰膽堿抗體阻斷劑復(fù)制實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力大鼠模型，并觀察葛根復(fù)方對(duì)重癥肌無力大鼠治療中IFN-γ和TGF-β1表達(dá)的影響。

1　材　料

1.1藥物葛根復(fù)方(葛根20g,黃芪、丹參、蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁各15g)藥物購自陜西中醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院藥房。中藥治療組大鼠藥物用量為臨床用量的6.25倍。陽性對(duì)照組(強(qiáng)的松)用0.2﹪的羧甲基纖維素鈉將強(qiáng)的松配置成0.54mg/mL混懸液備用。

1.2動(dòng)物80只雌性8周大SPF級(jí)的Lewis大鼠，體重160～180g,大鼠購買與西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SCXK(陜)2013-001.質(zhì)重統(tǒng)計(jì)學(xué)不存在差異。

1.3試劑與儀器由南京金斯瑞生物科技有限公司合成的鼠源性AchR-α亞基97-116肽段序列(the rat sequence 97-116 of the AchR α subunit,R97-116), 磷酸緩沖液(PBS)，強(qiáng)的松，完全弗氏佐劑(CFA),不完全弗氏佐劑(IFA),0.2﹪的羧甲基纖維素鈉, 生理鹽水，氨水，乙醇，水合氯醛，液氮，酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定試劑盒(ELESA), 550型酶標(biāo)儀(由美國Bio-Rad公司提供)。

2　方　法

2.1造模先將80只大鼠分為正常對(duì)照組10只和模型組70只，模型組大鼠四足底墊皮內(nèi)和腰腹部皮下注射含有100μg肽段的完全弗氏佐劑和PBS的混合乳液200μL。第2次免疫加強(qiáng)在初次免疫30天后進(jìn)行，第2次注射量為50μg肽段的不完全弗氏佐劑和PBS混合乳液200μL。正常對(duì)照組皮下注射等量PBS。

2.2篩選分組從模型組篩選出有明顯肌無力癥狀的大鼠60只，將其隨機(jī)分成B組(模型對(duì)照組)，C組(強(qiáng)的松)，D組(葛根復(fù)方組)，每組20只大鼠。

2.3給藥選擇造模成功的大鼠分組成功后給予藥物治療。大鼠藥物給予的劑量相當(dāng)于成人等效劑量的6.25倍，采用灌胃方式給藥(1mL/100g)。給予正常對(duì)照組和模型對(duì)照組0.9﹪氯化鈉溶液灌胃，強(qiáng)的松給藥計(jì)量為5.4mg/kg/d，葛根復(fù)方組給藥劑量為11.46g/kg/d。大鼠每日給藥一次，連續(xù)給藥4周。

2.4酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IFN-γ的表達(dá) 采用普遍應(yīng)用易操作的酶聯(lián)免疫吸附法，操作步驟：將從腹腔靜脈收集好的血液離心放置，采用大鼠IFN-γ試劑盒檢測(cè)分析，應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中的IFN-γ的表達(dá)，用純化的大鼠干擾素γ抗體包被微孔板制成固態(tài)抗體，微孔中依次加入IFN-γ，再與HRP標(biāo)記的羊抗屬抗體結(jié)合，形成復(fù)合物，徹底洗滌后加入底物TMB顯色。酶促反應(yīng)下呈藍(lán)色，并在酸的作用下終成黃色，顏色的深淺成負(fù)相關(guān)。酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度(OD值)。

2.5檢測(cè)胸腺組織中TGF-β1因子的表達(dá) 大鼠深度麻醉后，切割分離取出大鼠胸腺組織，稱取重量，加入定量的PBS,PH=7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。解凍后的組織在2-8攝氏溫度下，加入勻漿液手工研磨勻漿充分，加入細(xì)胞組織消化液，并用200目的篩網(wǎng)過濾掉未碾磨碎的團(tuán)裝組織，用2000～3000轉(zhuǎn)離心20min，收集上清液檢測(cè)，依照IFN-γ的檢測(cè)方法，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)TGF-β1因子的表達(dá)情況。

3　結(jié)　果

3.1大鼠的體重和肌力的變化在重癥肌無力試驗(yàn)中，大鼠的體重的變化和肌力的檢測(cè)往往作為肌無力模型制造是否成功和藥物治療是否有效的比較直觀的觀測(cè)指標(biāo)。試驗(yàn)中大鼠的肌無力癥狀越重體重的增長就越慢，甚至出現(xiàn)了負(fù)增長的趨勢(shì)。為了更具體的評(píng)價(jià)肌無力癥狀的輕重，目前比較廣泛采用的是Lennon肌力評(píng)分方法，lennon把大鼠的肌力評(píng)分根據(jù)其客觀的外在表現(xiàn)分為1,2,3,4級(jí)，肌力評(píng)價(jià)分值也會(huì)隨著肌無力癥狀的加重而升高[1]。大鼠的體重和肌力評(píng)分結(jié)果如下：和空白組大鼠相比，模型組的大鼠體重明顯偏低(P<0.01)，和模型組大鼠相比較，強(qiáng)的松治療組和中藥治療組的體重明顯增加(P<0.05)，中藥組大鼠和模型組大鼠的體重?zé)o明顯差異(P>0.05)；和空白組比較，模型組大鼠的肌力評(píng)分明顯偏高(P<0.01)，和模型組大鼠比較，強(qiáng)的松治療組和中藥治療組的肌力評(píng)分明顯降低了(P<0.05)，中藥治療組和強(qiáng)的松治療組的肌力評(píng)分比較，強(qiáng)的松組稍微偏高(P<0.05)。結(jié)果表示中藥治療確實(shí)有一定效果，見表1。

表1　大鼠的體重變化和肌力評(píng)分的對(duì)比±s)

注：與空白組比較,△P<0.01；與模型組比較,▲P<0.05；與強(qiáng)的松組比較□P<0.05

3.2 IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果 大鼠肌無力模型制造成功后，采取體外靜脈取血的方法檢測(cè)血清中IFN-γ因子的含量水平，并在藥物治療周期結(jié)束后，同樣靜脈采血檢測(cè)血清中IFN-γ因子的含量，并作治療前后的含量對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果顯示：治療前與空白組比較，肌無力模型制造各組大鼠血清中IFN-γ因子的含量水平顯著升高(P<0.01)，治療后與模型組比較，強(qiáng)的松治療組和中藥治療組中大鼠血清中IFN-γ含量水平顯著降低(P<0.05)；治療后強(qiáng)的松治療組和中藥組中IFN-γ含量比較，差異不明顯。結(jié)果顯示強(qiáng)的松，中藥組的治療都有效果，中藥組的治療效果達(dá)到預(yù)期效果，并表明在肌無力的發(fā)病初期，IFN-γ可以促進(jìn)肌無力病程加快，其含量OD值和肌無力癥狀成正比，這說明IFN-γ在肌無力發(fā)病過程中有重要的檢測(cè)意義，可以為肌無力的發(fā)病機(jī)理的研究提供更多幫助。結(jié)果見表2

表2　治療前后大鼠血清中IFN-γ表達(dá)水平比較±s)

注：治療前與空白組比較,△P<0.01； 治療后與模型組比較,▲P<0.05

3.3TGF-β1的檢測(cè)結(jié)果 肌無力大鼠造模成功后，隨機(jī)選取大鼠5只取出胸腺，并研磨成懸液狀，離心提取上清液，檢測(cè)上清液中TGF-β1的表達(dá)，治療周期結(jié)束后，處理大鼠取胸腺并制作標(biāo)本，再次檢測(cè)上清液中TGF-β1的表達(dá)，并治療前后的比較。結(jié)果顯示：治療前和空白組比較，肌無力模型制造各組大鼠胸腺組織中TGF-β1表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，治療后與模型組大鼠比較，強(qiáng)的松治療組和中藥治療組中大鼠胸腺中TGF-β1表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；治療后中藥治療組和強(qiáng)的松治療組比較，中藥治療組中TGF-β1表達(dá)水平要偏高(P<0.05.)。

表3　治療前后大鼠胸腺組織中TGF-β1表達(dá)水平的比較(pg/mL ，x±S，)

注：治療前與空白組比較,△P<0.01； 治療后與模型組比較,▲P<0.05

4　討　論

重癥肌無力疾病作為一種疑難雜癥，目前西醫(yī)認(rèn)為是神經(jīng)阻斷，信號(hào)傳遞障礙導(dǎo)致的，故而臨床治療多應(yīng)用抗堿酯酶藥物及免疫抑制劑，這些藥物或多或少會(huì)帶來些副作用，如瞳孔縮小，多口水，出汗，腹痛，腹瀉等，而且患者會(huì)產(chǎn)生藥物的長期依賴性，對(duì)機(jī)體的長期傷害難以估計(jì)，所以許多醫(yī)者試圖從中醫(yī)“痿證”的角度出發(fā)探討其機(jī)理，并試圖找到緩解治療的辦法，并且近些年來已經(jīng)取得了值得肯定的成果。本實(shí)驗(yàn)從中醫(yī)臟腑學(xué)說為出發(fā)點(diǎn)，認(rèn)為發(fā)病的部位肌肉多和脾有關(guān)，脾主四肢肌肉，脾主運(yùn)化和全身氣機(jī)的化生，并且脾臟和相應(yīng)的免疫器官主宰者機(jī)體免疫功能，所以認(rèn)為主肌無力主要因?yàn)槠⒎翁撊?，生化乏源，脾虛失運(yùn)，氣虛下陷，水濕阻滯，蘊(yùn)而生熱，同時(shí)可能夾雜衛(wèi)外不固，而外感風(fēng)寒濕之邪，最終導(dǎo)致邪實(shí)正虛，氣血運(yùn)行不暢，濕熱困阻于肌肉筋膜，出現(xiàn)虛實(shí)夾雜的癥狀，針對(duì)這種病機(jī)，本實(shí)驗(yàn)擬葛根復(fù)方試從輸肌驅(qū)邪，益氣健脾，清熱利濕的角度出發(fā)來治療肌無力病證。方藥選擇葛根，黃芪，丹參，蒼術(shù)，黃柏，牛膝，薏苡仁來配伍，方中葛根既可以輸肌以驅(qū)邪，清熱利水，輸肌以通絡(luò)；黃芪補(bǔ)脾肺之氣，益氣實(shí)衛(wèi)；丹參可以清熱以活血，涼血祛瘀；再合四妙，燥濕清熱，利水活血，疏通經(jīng)絡(luò)，引濕熱從下焦而去，牛膝并可強(qiáng)健筋骨，舒筋緩急[2-3]。全方攻補(bǔ)兼施，益氣健脾，清熱利濕，活血祛瘀，治療脾肺氣虛，濕熱內(nèi)阻進(jìn)而擬提高機(jī)體免疫力，達(dá)到驅(qū)邪強(qiáng)體的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明對(duì)肌無力癥狀起到了一定的療效。

本課題探討了重癥肌無力的發(fā)病機(jī)理，認(rèn)為免疫功能的失調(diào)可能是其中一種發(fā)病原因，繼而從中醫(yī)的角度探討相關(guān)脾主肌肉四肢的理論學(xué)說，采取了補(bǔ)消并施的治療方法來益氣健脾，清熱祛濕，已達(dá)到驅(qū)邪扶正的治療目的，最終取得了值得認(rèn)可的效果。

[1] Lennon VA, Griesmann GA, McCormick DJ, et al.Definition of myasthenogenic Sites of the Human acetylcholine Receptor Using Synthetic Peptides [J], Ann NY Acad Sci, 1987, 505:439-450.

[2] 龍志剛,廖小平,文國強(qiáng),等.神經(jīng)免疫性疾病TGF-β1與糖皮質(zhì)激素的關(guān)系[J].中國誤診學(xué)雜志,2000,2(2):168-169.

[3] 文穎娟，周永學(xué)，王江.基于“線粒體-肌肉-脾”探討脾胃失調(diào)與重癥肌無力發(fā)病的關(guān)系[J].現(xiàn)代中藥，2013,33(5):25-28.

(收稿2015-03-16；修回2015-04-30)

R746.1

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.09.084

*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202642)

陜西省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2013JK0823)

主題詞 重癥肌無力 葛根復(fù)方 干擾素γ 轉(zhuǎn)化生長因子-β1