蔡雨函，周遠(yuǎn)成，艾 能，李 碧，潘 夢

（四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610299）

一例豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

蔡雨函，周遠(yuǎn)成*，艾 能，李 碧，潘 夢

（四川華神獸用生物制品有限公司 四川省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610299）

對南充市某豬場的一起疫情進(jìn)行確診，采集病死仔豬的病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。PCR結(jié)果顯示豬瘟病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬偽狂犬病毒均為陽性。試驗(yàn)結(jié)果表明，該豬場疫情是由CSFV、PRRSV和PRV混合感染所致。

豬瘟；高致病性豬藍(lán)耳??；豬偽狂犬?。换旌细腥?/p>

2015年3月中旬，南充市某小規(guī)模豬場仔豬發(fā)生了以高熱、食欲廢絕、皮膚發(fā)紅、腹瀉、后軀麻痹、有個別呼吸困難為主要特征的傳染病。解剖后觀察可見腦膜明顯充血、水腫，腦脊髓液增多；全身淋巴結(jié)腫大、出血，呈大理石狀；腎臟呈土黃色、有點(diǎn)狀出血；喉頭、氣管和支氣管有黏液性泡沫并充血；肝臟、脾臟有壞死灶；回盲口見一個個輪層狀潰瘍。查看該群仔豬的免疫記錄： 30日齡、60日齡時各免疫注射1次豬瘟疫苗， 45～60日齡接種豬丹毒與豬肺疫二聯(lián)疫苗、鏈球菌疫苗。母豬空懷期注射過豬瘟疫苗、鏈球菌疫苗， 但沒有注射豬偽狂犬病和豬藍(lán)耳病疫苗。該場發(fā)病后使用抗生素治療，均無效果。實(shí)驗(yàn)室診斷確診為豬瘟（CSFV）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬偽狂犬病毒（PRV）混合感染，現(xiàn)報告如下，以期為今后豬病的診斷和防控提供參考。

1　材料與方法

1.1病料采集

無菌采集死亡仔豬的頜下淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、扁桃體、腦等組織。

1.2試驗(yàn)試劑

2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000購自北京天根生化科技有限公司；TaKaRa RNAiso Plus、PrimeScript RT Kit、2×GC buffer、 dNTP、Mg2+、rap 酶購自大連寶生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中CSFV和PRV的核酸序列分別設(shè)計引物，其中CSFV陽性擴(kuò)增片段為270 bp，PRV陽性擴(kuò)增片段為192 bp。參照周丹（2012）建立的鑒別診斷PRRSV普通株與變異株RT-PCR方法，區(qū)分是經(jīng)典PRRSV感染還是高致病性PRRSV感染（豬藍(lán)耳病病毒普通株擴(kuò)增片段為267 bp，變異株擴(kuò)增片段為180 bp）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（見表1）。

1.4細(xì)菌學(xué)檢測

1.4.1觸片鏡檢 將無菌采集的病料觸片后革蘭氏染色鏡檢。

1.4.2分離培養(yǎng) 將無菌采集的病料接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察菌落生長情況。

1.5核酸提取

1.5.1總DNA的提取

取適量病變肺臟和腦組織置于研缽中，加入3～5倍體積的磷酸緩沖液（PBS）研磨成勻漿，-20 ℃反復(fù)凍融3次，取200 μL懸液加入蛋白酶K（終濃度為200 μg/mL），56 ℃水浴30 min；再加入等體積的Tris平衡酚，反復(fù)顛倒混勻；室溫 12 000 r/ min 離心10 min；吸取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25∶24∶1的混合液重復(fù)上述抽提步驟；轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，加入氯仿/異戊醇體積比為24∶1的混合液重復(fù)上述抽提步驟；向最后獲得的上清液中加入2倍體積的無水乙醇沉淀 DNA，室溫12 000 r/min離心10 min，再用 500 μL 700 mL/L乙醇洗滌1次；輕輕棄去無水乙醇，自然風(fēng)干，溶解于20 μL TE中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2總RNA的提取與cDNA的合成

取適量的頜下淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、扁桃體放入勻漿器里，加入1 mL TRIZOL裂解液進(jìn)行勻漿，勻漿充分后室溫靜置5 min，l2 000 r/min，離心5 min；取上清液，加入200 mL氯仿 （迅速振蕩），室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心 15 min；向最后獲得的上清液中加入等量異丙醇沉淀RNA，輕輕搖晃混勻，室溫作用10 min后，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加1mL 700 mL/L冰乙醇，12 000 r/min離心5 min，輕輕棄去無水乙醇，自然風(fēng)干，溶解于20 μL 無Rnase水中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑諏毶锕こ蹋ù筮B）有限公司RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測

反應(yīng)體系為：引物稀釋濃度為20 μmol/L，Primer Mix 1.5μl（P1∶P2∶P3=1∶1∶2），2×Mix 12.5 μL，cDNA 3 μL，加ddH2O至25 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min。同時設(shè)立陰性對照，PCR 產(chǎn)物用 10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定。

1.7豬瘟病毒檢測

利用套式PCR技術(shù)檢測CSFV，其中第一輪PCR反應(yīng)體系為：P4、P5（10 μmol/L）各 0.5 μL，2×Mix 12.5 μL，cDNA 2.5 μL， 加ddH2O至25 μL。第二輪PCR反應(yīng)體系為：P6、P7（10 μmol/L）各 0.5 μL，2×Mix 12.5 μL，第1輪PCR產(chǎn)物1 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件均為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min。同時設(shè)立陰性對照，PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定。

1.8豬偽狂犬病毒檢測

采用25 μL體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)， 其 中P8、P9（20 μmol/L） 各0.5 μL，2×GC buffer 12.5μl，dNTP 4μl， Mg2+1.5μl， rap 酶0.5μl， ddH2O 4.5 μL，DNA 1 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min。同時設(shè)立陰性對照，PCR 產(chǎn)物用 10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌分離

觸片鏡檢未見細(xì)菌，分離培養(yǎng)后無菌落生長，表明該豬場疫病不是由細(xì)菌感染所致。

2.2豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測

電泳結(jié)果（見圖1）顯示從病料中擴(kuò)增出180 bp的電泳條帶，表明為高致病性PRRSV感染陽性。

2.3豬瘟病毒檢測

電泳結(jié)果（見圖2）顯示從病料中擴(kuò)增出270 bp的電泳條帶，表明為豬瘟病毒感染陽性。

2.4豬偽狂犬病毒檢測

電泳結(jié)果（見圖3）顯示從病料中擴(kuò)增出192 bp的電泳條帶，表明為豬偽狂犬病毒感染陽性。

3　討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，病豬體內(nèi)未分離出任何細(xì)菌，即排除了由細(xì)菌感染所致；CSFV、PRRSV RT-PCR和PRV PCR檢測結(jié)果均為陽性，且結(jié)果顯示PRRSV為PRRSV變異毒株，因此本次疫病確診為豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病和豬偽狂犬病混合感染。本次疫情可能主要是由于該豬場沒有免疫豬偽狂犬病和豬藍(lán)耳病疫苗導(dǎo)致豬群患病，而豬偽狂犬病和豬藍(lán)耳病通過破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)會干擾豬瘟抗體產(chǎn)生，使豬瘟抗體水平大幅下降， 從而使豬群亦受到豬瘟病毒感染。因此，在做好豬瘟防疫工作的同時更要高度重視豬偽狂犬病和豬藍(lán)耳病的防疫工作。

圖1　PRRSV檢測結(jié)果

圖2　CSFV檢測結(jié)果

圖3　PRV檢測結(jié)果

豬瘟、豬偽狂犬病是當(dāng)前困擾我國豬場的主要病毒性疫病，管理不好的豬場豬藍(lán)耳病也會長期存在，使癥狀往往由典型轉(zhuǎn)為慢性經(jīng)過，給治療帶來很大難度。因此，平時要堅持做好基礎(chǔ)免疫工作，提高抗體水平。搞好豬舍的環(huán)境衛(wèi)生工作，做好保溫和通風(fēng)換氣工作，適當(dāng)降低保育豬的飼養(yǎng)密度，保證飼料營養(yǎng)的充足和均衡，給豬創(chuàng)造一個良好的營養(yǎng)和生長環(huán)境。疫情發(fā)生并確診后立即向上級獸醫(yī)部門匯報，制定緊急防疫措施；及時隔離發(fā)病豬，嚴(yán)格觀察可疑豬，對死亡病豬進(jìn)行無害化處理以防病原傳播，對豬場進(jìn)行全面消毒處理，控制細(xì)菌繼發(fā)感染；同時加強(qiáng)豬群的疫苗免疫，并使用干擾素和抗病毒藥物進(jìn)行治療。發(fā)病后及時隔離治療病豬、果斷淘汰帶毒豬是凈化豬群、控制持續(xù)感染的關(guān)鍵措施。

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化發(fā)展，近些年發(fā)生的豬傳染病，大多為多種因素導(dǎo)致多種病菌并發(fā)、繼發(fā)或混合感染，其中病原體的混合感染既有細(xì)菌+細(xì)菌，也有病毒+病毒和細(xì)菌+病毒，并造成一些豬傳染病以非典型或綜合征的形式出現(xiàn)，使豬病的診斷和防治的難度增加，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大影響，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。針對目前規(guī)模化豬場疫病的復(fù)雜局面，要樹立保健和預(yù)防觀念，采取合理的免疫程序，建立完善的預(yù)防方案。同時對患豬制定科學(xué)的用藥方案，正確配伍，協(xié)同用藥，辨證施治，綜合治療。

2015-07-21）

蔡雨函（1990-），女，四川南充人。

周遠(yuǎn)成，博士，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究，E-mail：abtczyc@163.com