魏成曉

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109）

長白豬TAS2R1基因克隆及序列分析

魏成曉

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109）

本研究通過引物合成、PCR擴(kuò)增、膠回收和測序?qū)﹂L白豬苦味受體基因1（TAS2R1基因）進(jìn)行序列分析。將測序得到的結(jié)果同GenBank中的TAS2R1基因序列進(jìn)行比對，共發(fā)現(xiàn)3處突變位點。分別位于該基因的228 bp、583 bp和712 bp處。其中，在228 bp處由T突變成C，屬于同義突變，其編碼的氨基酸無變化；在583 bp處由C突變成G，屬于錯義突變，編碼的氨基酸由亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸；在712 bp處由A突變成G，屬于錯義突變，編碼的氨基酸由亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸。通過生物學(xué)信息軟件DNAMAN分析，發(fā)現(xiàn)其與GenBank中的TAS2R1基因序列一致性達(dá)99.67%。

基因克?。婚L白豬；TAS2R1；序列分析

生物對苦味物質(zhì)的感知主要是通過苦味受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的，由許多苦味受體基因家族編碼所決定該受體的功能。由于苦味受體基因所表達(dá)的苦味物質(zhì)在自然界中的豐富性，以及膜蛋白在此種實驗中在細(xì)胞膜上難以表達(dá)［1］，因此必須利用分子技術(shù)進(jìn)行苦味受體基因的研究。現(xiàn)在新興的分子層面的技術(shù)包括比較基因組學(xué)和分子進(jìn)化理論以及進(jìn)化基因?qū)W手段，可以使我們了解苦味基因家族的演化歷史和演化驅(qū)動力，從而使我們在苦味基因的研究上取得一定的進(jìn)展?？茖W(xué)家對脫氧核糖核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，通過比對遺傳草圖上脊椎動物對苦味敏感的基因座位的具體方位，發(fā)現(xiàn)了動物體內(nèi)的2種相似的苦味受體基因［2］，將其定名為TRB與TAS2R。通過對人和小鼠的苦味受體基因探究，又重新發(fā)現(xiàn)了人具有10個TAS2R基因，而小鼠則具有30個TAS2R基因。至此，苦味基因在脊椎動物中的所有成員全部被找到。

本試驗成功克隆并分析了長白豬的TAS2R1基因序列，具體揭示了長白豬的這一段基因組成及發(fā)生突變的具體位置，為進(jìn)一步研究TAS2R1基因在其生長發(fā)育過程中的作用及分子進(jìn)化奠定了基礎(chǔ)。

1　試驗材料與方法

1.1試驗材料和主要儀器設(shè)備

長白豬耳樣取自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地，放入無水乙醇中保存帶回，于-20 ℃貯存。

所需10×PCR Buffer、dNTP、rTaq DNA聚 合 酶；PCR擴(kuò) 增 儀（BIO RAD，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech，美國）；低溫高速離心機(jī)（Heraeus，德國）；-80 ℃超低溫冰箱（海爾，中國）；移液器（Eppendorf，德國）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q）；高壓滅菌鍋（Hirayama，日本）等。

1.1.1主要試劑的配制

1）50×TAE 的配制。先精確稱取C4H11NO3 242 g，EDTA-2Na 37.2 g放在燒杯內(nèi)，其次添加900 mL的去離子水，經(jīng)過充分?jǐn)嚢韬笫蛊淙芙狻Ｗ詈筇砑?7.2 mL的CH3COOH，使其完全混勻，最后用去離子水定容達(dá)到1 L，放置在室溫下儲存。

2）1×TAE 的配制。精確量取20 mL 50×TAE 濃儲液，向其中添入蒸餾水定容，使之達(dá)到1 000 m L，上下顛倒充分混勻待用。

3）1MTris·Cl（pH8.0）。把24.22 gTris放置于80 mL雙蒸餾水中使其溶解，向其中加入濃HCl，將其pH調(diào)節(jié)到8.0，定容到200 mL，進(jìn)行高壓滅菌后，于4 ℃保存。

4）10%SDS。在60 ℃的條件下，將20 gSDS加入超純水中溶解，通過滴加稀HCl，將其pH調(diào)節(jié)到7.2，定容到200 mL，放置于室溫保存。

5）0.5MEDTA（pH8.0）。稱出93 gNa2EDTA·2H2O在160 mL超純水中溶解，將其混合均勻后加入2 g左右NaOH，將其pH調(diào)節(jié)到8.0，使其定容到200 mL，于4 ℃高壓滅菌后保存。

6）蛋白酶K（20 mg/mL）：將200 mg蛋白酶在10 mL超純水中溶解，混合均勻后，定容至500 μL分裝，放置在-20 ℃冷凍儲藏。

1.2耳樣的采取

將耳號鉗用75%的酒精棉消毒，剪下剛出生仔豬的耳樣1～2塊，放入1.5 mL盛有75%酒精的離心管內(nèi)，帶回實驗室，于-20 ℃保存。

1.3DNA的提取

取豬耳樣一小塊，洗凈后，用剪刀剪碎放在于1.5 mL的滅菌離心管內(nèi)，按照以下步驟進(jìn)行操作：

1）加入600 μL組織提取液（10mM EDTA（pH=8.0）+10 mM Tris-Hcl（pH=8.0）），其 次 向 其 中 加 入10%SDS10 mL/mL蛋白酶K使最終濃度達(dá)到1%、100 μg/mL，55%消化過夜；

2）于第2天將溶液冷卻使其達(dá)到室溫后，導(dǎo)入入體積相等的三羥甲基氨基甲烷飽和酚，將管蓋蓋緊，使離心管緩慢顛倒，顛倒10 min以上即可，12 000 r/min下離心15 min；

3）將體積相等的飽和酚加入上層清液中：氯仿（1：1），將管蓋蓋緊，將離心管緩慢顛倒，顛倒最少10 min以上，12 000 r/min下離心15 min；

4）取上層清液，向其中加入體積相等的三氯甲烷：異戊醇（24：1），將管蓋蓋緊，使離心管緩慢顛倒，最少持續(xù)10 min以上，12 000 r/min下離心15 min；

5）取上層清液，加入1/10體積的2 mol/L CH2CH3NaO2和2倍體積的C2H5OH，管蓋蓋緊后，使離心管緩慢顛倒，出現(xiàn)白色絮狀DNA為止，12 000 r/min下離心4～6 min；

6）將上層清液倒掉，并加入400 μL70%無水乙醇經(jīng)過2次洗滌后，管蓋蓋緊后，將離心管緩慢顛倒，12 000 r/min下離心4～6 min，棄掉管內(nèi)乙醇，把離心管顛倒在吸水紙上，經(jīng)干燥處理后，使其溶解，放置于-20 ℃下用來保存以及以后使用。

1.4引物的設(shè)計與合成

依據(jù)目的基因TAS2R1設(shè)計一對引物，通過上海生工合成：

上游引物：5′AGCAAATGTCT GCCATCTTCC 3′，

下游引物：5′GGACATCTTTG CTGGGCTGG 3′。

PCR的 反 應(yīng) 體 系：10xBuffer 2.5 μL，18.3 μL滅菌蒸餾水，dNTPMix1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，TapDNApolymerase（5U/ μL）0.2 μL，DNA模板1 μL。

PCR的反應(yīng)條件：95 ℃，將其預(yù)變性3 min；94 ℃，變性30 s；58 ℃，退火40 s；72 ℃，延伸50 s；返回到變性過程并運用30個循環(huán)；72 ℃，延伸10 min；然后于4 ℃保存。PCR反應(yīng)完成時選取5 μL產(chǎn)物，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗。

1.5基因片段的回收、純化、和測序

PCR的產(chǎn)物經(jīng)由1%瓊脂糖凝膠電泳后，對切下的目的基因（1189 bp）片段，選取膠回收純化試劑盒進(jìn)行回收。具體的方法如下：

1）將每100 mg凝膠加入約400 μL的BindingBuffer，放置于50 ℃水浴10 min，每2 min顛倒混勻1次。

2）用2.0 mL收集管中的吸附柱收集融化的膠溶液，在室溫下靜置2 min后，室溫下8 000 r/min離心2 min。

3）將吸附柱拿下，收集管中的廢液全部倒掉，把UNIQ-10柱插入收集管內(nèi)，將600 μLWash Solution加入其中，10 000 r/min室溫離心40 s。重新洗滌1次。

4）將吸附柱拿下，收集管中的廢液全部倒掉，把UNIQ-10柱插入收集管內(nèi)，室溫下10 000r/min離心15 s。

5）將吸附柱放進(jìn)新管中，將20μL Elution Buffer，55 ℃水浴2 min。25 ℃ 10 000 r/min離心3 min，將DNA片段進(jìn)行回收，就是離心管內(nèi)的液體。

2　試驗結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

通過1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在1 189 bp處獲得一條清晰的條帶（圖1），與目的條帶大小基本一致。

2.2序列測定結(jié)果

測序結(jié)果顯示和GenBank里的TAS2R1基因序列一致性達(dá)99.67%。DNAMAN序列比對結(jié)果如下：

圖1　TAS2R1基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖

2.3SNPs分析

通過查看TAS2R1基因擴(kuò)增產(chǎn)物序列測定結(jié)果，共顯示3個雙峰位置。將所檢測出的SNPs與GenBank中的TAS2R1進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)3個突變位。上述結(jié)果表明，第228 bp處發(fā)生了突變，由T變成了C，該突變?yōu)橥x突變；第583bp處發(fā)生了突變，由C變成了G，該突變?yōu)殄e義突變，編碼的亮氨酸變成了纈氨酸；第712 bp處發(fā)生了突變，由A變成了G，該突變?yōu)殄e義突變，編碼的氨基酸由異亮氨酸變成了纈氨酸。通過DNAman比對發(fā)現(xiàn)一致性達(dá)99.67%。將所檢測出的SNPs與GenBank比對，發(fā)現(xiàn)3個突變位點中有3個在外顯子區(qū)域，其中導(dǎo)致錯義突變的有2個。

3　結(jié)論與討論

本研究對長白豬TAS2R1基因的研究結(jié)果表明，長白豬該基因的結(jié)構(gòu)與人、牛、馬、羊和小鼠等其他哺乳動物種類的一樣，基因內(nèi)部無內(nèi)含子，即整個閱讀框架只有1個外顯子組成，其起始密碼子ATG上游的第3個核苷酸是腺嘌呤，緊跟在ATG后面的核苷酸是鳥嘌呤，這與“Kozak序列”特征一致。符合大多數(shù)真核生物起始密碼子所具有的結(jié)構(gòu)特征，說明本研究得到的TAS2R1基因結(jié)構(gòu)是正確的?？辔妒荏w基因家族，具有3個細(xì)胞外環(huán)和3個細(xì)胞內(nèi)環(huán)，并且相互對應(yīng)。處于TAS2R1細(xì)胞外的N端非常短，也許作為配體結(jié)合區(qū)域，多態(tài)性特別明顯，可與多種結(jié)構(gòu)的苦味物質(zhì)相結(jié)合?？辔妒荏w細(xì)胞中則具有3個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其保守性很高，作為細(xì)胞中G蛋白偶聯(lián)片段。TAS2R1受體能夠識別苦味物質(zhì)，主要依賴于基因家族中不同的受體基因能夠與不同的苦味受體物質(zhì)結(jié)合。若是長白豬屢次和具有特殊苦味的物質(zhì)接觸，也許會增強它們在日后辨別該特種有毒物質(zhì)的能力。經(jīng)過對有限的基因序列資料進(jìn)行整合，可以打破TAS2R1基因序列數(shù)目有限的缺陷，使得到的研究結(jié)果能夠為我們提供些許TAS2R1基因的演化過程。盡管不同豬物種的食性不同，但是通過研究長白豬的食性選擇，或許能夠揭示食性選擇在基因進(jìn)化中的動力作用。kim等（2003）對與苯硫脲（phenyl thiocarbamide，PTC）苦味感知相關(guān)的苦味受體T2R38的研究結(jié)果則表明，PTC味感知者和PTC味非感知者間的差異僅僅是由于T2R38氨基酸序列上3個氨基酸的替換所致。根據(jù)Kim等的研究結(jié)果，我們可以推測本研究中發(fā)現(xiàn)的3處SNPs可能會對苦味物質(zhì)識別產(chǎn)生一定的影響。通過這個研究，我們或許能夠深入的探討物種形成機(jī)制的差異［3］。

圖2　DNAMAN序列比對結(jié)果

圖3　TAS2R1基因測序結(jié)果峰圖

表1　　TAS2R1基因的SNP分布

本研究通過對長白豬TAS2R1基因的nucleotide和它的脫氧核苷酸所編碼蛋白的序列進(jìn)行分析，揭示了其序列特征。對TAS2R1基因的多樣性、基因表達(dá)調(diào)節(jié)和長白豬苦味受體的分子演化順應(yīng)等方向的研究具有一定意義，同時為長白豬苦味基因遺傳資源的開發(fā)和保護(hù)應(yīng)用提供了有力支持。然而，多個基因成員組成了苦味受體基因家族，TAS2R1基因也只是在其中占據(jù)了一小部分。為了深入透徹的揭曉長白豬苦味系統(tǒng)的遺傳特征，需要我們進(jìn)行更深層次的探究。

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2015-10-22）