蘇遠(yuǎn)科 王志宏 呂斐 羅曉 崔常勇

（龍口出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東龍口 265700）

冷卻牛肉表面微生物分離、監(jiān)測(cè)與初步鑒定

蘇遠(yuǎn)科 王志宏 呂斐 羅曉 崔常勇

（龍口出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東龍口 265700）

［目的］對(duì)冷卻肉表面的微生物進(jìn)行分離、檢測(cè)與鑒定，為冷卻肉微生物安全評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供技術(shù)支撐。［方法］采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基對(duì)普通冷卻牛肉表面主要微生物菌群進(jìn)行分離、篩選，并利用用API條或VITEK2 Compact進(jìn)行菌株的初步鑒定。［結(jié)果］本研究共分離13株表面微生物，其中G+菌株6株，G—菌株7株；G+菌中2株為乳酸菌屬、1株為索絲菌屬、3株為李斯特氏菌屬；G—菌中4株為腸桿菌科、3株為假單胞菌屬。［結(jié)論］冷卻牛肉表面存在多種致腐敗微生物，應(yīng)對(duì)冷卻牛肉建立合理的監(jiān)測(cè)、預(yù)測(cè)及預(yù)報(bào)系統(tǒng)。

冷卻牛肉；微生物分離；微生物監(jiān)測(cè)；鑒定

1 前言

冷卻肉是按照嚴(yán)格的宰前檢疫、宰后檢驗(yàn)的要求，采取合理的屠宰加工工藝流程，在低溫環(huán)境下進(jìn)行分切加工，使屠宰體中心肉溫在24 h內(nèi)迅速降至4℃以下，并在加工、運(yùn)輸及銷(xiāo)售過(guò)程中始終保持低溫冷藏鏈的預(yù)冷加工肉［1，2］。近年來(lái)冷卻肉在大中城市的市場(chǎng)上已經(jīng)有一定的市場(chǎng)份額，且其將可能成為我國(guó)生肉消費(fèi)的主流。雖然冷卻肉處于低溫環(huán)境下，能有效抑制微生物的生長(zhǎng)及繁殖，但是，由于內(nèi)源性污染和外源性污染的因素，冷卻肉也會(huì)受到一些致腐敗微生物的污染［3-5］。健康牲畜的身體表面、呼吸道、免疫器官及上呼吸道等部位均存在一些內(nèi)源性的微生物，可能會(huì)對(duì)冷卻肉造成影響。同時(shí)，加工過(guò)程中的用水、加工環(huán)境中的空氣以及從業(yè)人員等均可能對(duì)冷卻肉造成外源性污染［6］。本研究對(duì)部分冷卻肉表面的微生物進(jìn)行分離、檢測(cè)與鑒定，為冷卻肉微生物安全評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供技術(shù)支撐。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1試驗(yàn)樣品

冷卻牛肉購(gòu)自龍口家家悅超市未包裝冷卻牛肉。

2.1.2儀器與設(shè)備

均質(zhì)儀：日本ELMEX公司產(chǎn)品；培養(yǎng)箱：德國(guó)MEMERT公司產(chǎn)品；高壓滅菌器：日本YAMATO公司產(chǎn)品；顯微鏡：德國(guó)萊卡公司產(chǎn)品。

2.1.3試劑

無(wú)菌均質(zhì)袋、3M涂膜棒、培養(yǎng)基：均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

2.2方法

2.2.1樣品處理

從肉塊表面取樣，參照GB/T4789.17-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)肉與肉制品檢驗(yàn)》使用滅菌棉拭子擦拭法，使用10個(gè)棉拭子共擦拭50 cm2，然后投入盛有50 mL無(wú)菌水的三角瓶中充分震蕩搖勻立即檢測(cè)。取均勻液1 mL按照10×遞增稀釋至10-5濃度，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，傾注平板計(jì)數(shù)。

2.2.2計(jì)數(shù)與菌株分離

采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)測(cè)定，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h。特定的微生物種群分離采用特定的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度，見(jiàn)表1。

表1　特定微生物種群的分離培養(yǎng)基及分離溫度

2.2.3分離純化與鑒定

在表1的選擇性培養(yǎng)基上挑選典型菌落，并在對(duì)應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離培養(yǎng)，獲得純化的單菌落用于菌種或?qū)俚蔫b定。菌種或?qū)俚蔫b定采用生物梅里埃公司的API條和VITEK Compact2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。

2.2.4微生物菌落總數(shù)測(cè)定

細(xì)菌總數(shù)參考GB4789.2-2013《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》要求進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)數(shù)平板為瓊脂，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間2 d。

3 結(jié)果

3.1不同時(shí)間取樣微生物計(jì)數(shù)分析

本研究發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，冷卻肉表明的微生物總數(shù)逐漸增加，但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，菌落總數(shù)趨于穩(wěn)定，見(jiàn)圖1。

圖1　不同時(shí)間取樣微生物總數(shù)計(jì)數(shù)分析

3.2分離獲得的6株革蘭氏陽(yáng)性菌菌落特征分析

本研究分離的13株菌中革蘭氏陽(yáng)性菌有6株，且均無(wú)芽孢；6株菌株中有桿菌3株，球菌或卵圓形菌3株；表面濕潤(rùn)的菌株有3株，表面粘稠的菌株有3株；6株菌株中均不透明。詳見(jiàn)表2。

表2　分離獲得的6株革蘭氏陽(yáng)性菌菌落特征分析

3.3分離獲得的7株革蘭氏陰性菌菌落特征分析

本研究分離的13株菌中革蘭氏陰性菌有7株，且均無(wú)芽孢；7株菌株中均為桿菌；表面濕潤(rùn)的菌株有3株，表面呈現(xiàn)奶油狀的菌株有4株；7株菌株中均呈現(xiàn)半透明狀。詳見(jiàn)表3。

表3　分離獲得的7株革蘭氏陰性菌菌落特征分析

3.4API條及全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定分型

本研究分離的13株表面微生物中G+菌株6株，G—菌株7株。6株G+菌中2株為乳酸菌屬、1株為索絲菌屬、3株為李斯特氏菌屬；7株G—菌中4株為腸桿菌科、3株為假單胞菌屬。

4 討論

冷卻肉是目前市場(chǎng)上的重要的肉類(lèi)產(chǎn)品，其市場(chǎng)占有率有逐年升高的趨勢(shì)。冷卻的主要作用是將環(huán)境溫度降低到微生物能夠生長(zhǎng)或繁殖的溫度以下，降低微生物體內(nèi)的代謝酶活性，抑制生長(zhǎng)速度、延長(zhǎng)繁殖時(shí)間。如果環(huán)境溫度降低至最低生長(zhǎng)溫度界限時(shí)，微生物則徹底停止生長(zhǎng)。比如在3℃條件下，肉類(lèi)產(chǎn)品中的主要致病微生物如金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌及沙門(mén)氏菌等均生長(zhǎng)停止。不同微生物的生長(zhǎng)特性不同，因此，不同溫度下肉類(lèi)食品中微生物菌群的構(gòu)成會(huì)有較大的差異性［7，8］。

冷卻牛肉處在一系列的低溫條件下，能夠抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)，因此，隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，菌落總數(shù)不會(huì)劇烈增加。本研究中也發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)會(huì)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，卻不會(huì)呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)別的增加。雖然低溫可以抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)，但是冷卻肉中的一些腐敗細(xì)菌，如假單胞菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌科細(xì)菌及乳酸桿菌等卻可以生長(zhǎng)，本研究結(jié)果菌落總數(shù)會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加也證實(shí)了這一點(diǎn)。李斯特氏菌為兼性厭氧菌，為革蘭氏陽(yáng)性菌，是土壤中的腐生菌，能以死亡或腐爛的有機(jī)物為食。此外，李斯特氏菌主要以食物為傳染媒介，是主要的食源性病原菌。目前，已有的研究證實(shí)李斯特氏菌可以引起肉類(lèi)、蛋類(lèi)、乳制品、海產(chǎn)品及禽類(lèi)等的腐敗變質(zhì)。在對(duì)河北省即食食品中單增李斯特菌菌污染及耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌的總污染率達(dá)到1.34%，且對(duì)15中抗生素的耐藥率達(dá)到13.97%，其耐藥性還有逐步增長(zhǎng)的趨勢(shì)［9］。在對(duì)呼和浩特市單增李斯特氏菌污染的調(diào)查分析中也發(fā)現(xiàn)呼和浩特市市售食品單增李斯特氏菌的陽(yáng)性率達(dá)到4.71%，且散裝食品污染更為嚴(yán)重［10］。本研究也發(fā)現(xiàn)冷卻牛肉中的單增李斯特氏菌是表面污染菌的重要組分，且比例達(dá)到了23.4%（3/13）。另外，假單胞菌屬也是引起肉類(lèi)腐敗的重要菌類(lèi)［11］。同時(shí)，在對(duì)食源性假單胞菌16S rRNA鑒定及食品腐敗特性的研究中也發(fā)現(xiàn)了三株從市售魚(yú)中分離的假單胞菌，且均具有蛋白水解活性、生物膜形成能力及嗜鐵素產(chǎn)生能力［12］。本研究中分離的13株冷凍肉表面的微生物中假單胞菌屬也占到3株，因此，假單胞菌屬也是引起肉類(lèi)腐敗的重要微生物。

5 結(jié)論

冷卻牛肉處在一系列的低溫條件下，能夠抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)，但一些腐敗細(xì)菌，如假單胞菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌科細(xì)菌及乳酸桿菌、李斯特氏菌等卻可以生長(zhǎng)。因此，冷卻牛肉表面存在多種致腐敗微生物，應(yīng)對(duì)其建立合理的監(jiān)測(cè)、預(yù)測(cè)及預(yù)報(bào)系統(tǒng)。

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The Isolation，Detection and Identification of Surface Microorganism in Chilled Beef

Su Yuanke，Wang Zhihong，Lv Fei，Luo Xiao，Cui Changyong
（Longkou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Longkou，Shandong，265700）

［Objective］The present research aimed to propose a technical support for chilled meat by isolating，detecting and identifying the surface microorganism in chilled beef.［Methods］The surface microorganisms were isolated by basal culture medium and selective medium.The stain was detected by API or VITEK2 Compact instrument.［Results］13 stains were isolated in the present research，which containing 6 gram-positive stains and 7 gram-negative stains.The present research also showed that 13 stains contained 2 stains lactobacillus，1 stain of Brochothrix，3 stains of Listeria Monocytogenes，3 stains of Pseudomons and 4 stains of Enterobacteriaceae.［Conclusion］Various kinds of microorganisms were exists in chilled beef and rational forecast system must be build in order for good operation.

Chilled Beef；Microorganism Isolation；Microorganism Detection；Identification

TS207.4

E-mail：suyuanke@163.com

2015-10-21