閆平平齊欣黃大亮*王海燕崔妍田卓張麗榮

（1.大連出入境檢驗檢疫局遼寧大連116600；2.大窯灣出入境檢驗檢疫局）

中國北方沿海14種經(jīng)濟魚類和7種鰈科魚類的PCR-RFLP分析

閆平平1齊欣1黃大亮1*王海燕2崔妍1田卓1張麗榮1

（1.大連出入境檢驗檢疫局遼寧大連116600；2.大窯灣出入境檢驗檢疫局）

以中國北方沿海14種經(jīng)濟魚類（日本下鱵魚、斑尾復(fù)鰕虎魚、黃尾鰤、鳙魚、大瀧六線魚、綠鰭馬面鲀、大菱鲆、日本笠鳚、絨杜父魚、牙鲆、斑紋條鰨、長吻紅舌鰨、方式云鳚、大西洋鱈）和7種鰈魚（粗壯擬庸鰈魚、黃蓋鰈、亞洲箭齒鰈、星斑川鰈魚、馬舌鰈、木葉鰈、石鰈）為研究對象，首先對其線粒體16S rRNA基因片段進行PCR擴增及序列同源性比對，隨后采用Dde I、Hae III和Nla III 3種限制性內(nèi)切酶對21種魚類的細胞色素b基因序列進行限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）分析，并利用芯片生物分析技術(shù)得到酶切產(chǎn)物的特異性圖譜和確切片段大小，結(jié)果共檢出132個電泳條帶，實現(xiàn)了21種魚類的有效鑒別。本文為魚類種類鑒定和魚類食品檢測提供了科學(xué)依據(jù)。

經(jīng)濟魚類；鰈科；PCR-RFLP；16S rRNA；細胞色素b

1 前言

隨著海產(chǎn)品消費量的增大，來料加工的魚種復(fù)雜，魚類產(chǎn)品加工處理中以次充好的現(xiàn)象日益嚴重，其中最為常見的手段是以低廉魚類冒充名貴魚類，這一行為不僅嚴重地損害了消費者的利益，也對食品檢驗工作提出了新的挑戰(zhàn)。

魚類品種鑒定通常采用形態(tài)學(xué)方法，然而有些魚類由于形態(tài)相近并且經(jīng)加工處理使魚失去了用于形態(tài)辨別的部分，使得鑒定變得十分困難。分子生物學(xué)技術(shù)為魚種鑒定提供了新的途徑，因為即使魚類經(jīng)過加工也能獲取較為完整的DNA分子，該類方法具有很好的靈敏度、特異性和可靠性［1，2］。近年來，限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）法由于具有簡便、成本低、通量大等特性，已成功應(yīng)用于多種魚類及其產(chǎn)品的鑒定，包括帶魚［3］、鯖［4］、竹？魚［5］、鱈［6］、金槍魚［7］和鮟鱇［8］等，同時也為其形態(tài)學(xué)鑒定提供了輔助手段。

本研究首先采用PCR技術(shù)對中國沿海14種經(jīng)濟魚類和7種鰈科魚類的16S rRNA基因進行擴增及序列比對分析，隨后利用Dde I、Hae IIII和Nla III 3種限制性內(nèi)切酶對21種魚類的細胞色素b基因序列進行PCR-RFLP分析，并應(yīng)用生物芯片技術(shù)對酶切產(chǎn)物進行數(shù)字化，旨在建立一種簡便、快速、可靠性高的魚類品種鑒定方法。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1試驗材料

14種經(jīng)濟魚類和7種鰈科魚類：均采自來料加工的深海魚類產(chǎn)品，并附有捕撈證和衛(wèi)生證明。本研究所用魚類均經(jīng)過大連海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖中心的魚種鑒定和確認。

2.1.2試劑

DNA提取試劑盒、PCR-RFLP魚種鑒定試劑盒、DNA 1000芯片試劑盒：均購自Agilent公司；引物由上海生工公司合成。

2.2方法

2.2.1基因組DNA的提取

取50 mg魚肉，剪碎后置于離心管中，按照DNA提取試劑盒說明書進行魚類基因組DNA提取，紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.216S rRNA基因的PCR擴增及序列比對

16S基因片段擴增用的通用引物序列為：16Sar：5’-cgcctgtttatcaaaaacat-3’［9］，16Sbr：5’-ccggtctgaactcaga tcacgt-3’［9］。PCR反應(yīng)在ABI階梯PCR儀上進行，25 μL反應(yīng)體系內(nèi)含：ddH2O 16.8 μL、10×Taq buffer 2 μL、dNTP 2 μL（2.5 mM）、正反引物各1 μL（10 μM），Taq酶0.2 μL（0.25 U）和模板DNA 2 μL（100 ng）。PCR反應(yīng)條件：94℃2 min，94℃30 s，52℃40 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收測序。

利用Blast在線工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/）對21種魚測序結(jié)果進行同源性序列比對。

2.2.3細胞色素b基因的PCR擴增和酶切

根據(jù)Hold等［10］的報道選取464 bp的細胞色素b基因特異性片段作為目的片段，擴增用引物序列為L14735：5'-AAA AACCAC CGT TGT TAT TCA ACT A-3'，H15149：5'-GCICCT CAR AAT GAY ATT TGT CCT CA-3'。25 μL反應(yīng)體系內(nèi)含：ddH2O 9 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、正反引物混合液2.5 μL和模板DNA 1 μL（100 ng）。PCR反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)；72℃7 min。

取2.5 μL擴增產(chǎn)物分別與2.5 μL限制性內(nèi)切酶Dde I、Hae III或Nla III混勻，37℃酶切2 h以上，加入1 μL 60 mmol/L EDTA溶液，混勻，65℃保溫15 min以終止反應(yīng)。

2.2.4芯片生物技術(shù)分析

應(yīng)用芯片生物技術(shù)分別對上文制備的21種魚類16S rRNA基因擴增產(chǎn)物和細胞色素b基因的酶切產(chǎn)物進行分析。

按照DNA 1000芯片試劑盒說明書在相應(yīng)芯片孔中依次加入9 μL預(yù)染膠、5 μL陽性對照、1μL DNA相對分子質(zhì)量標準物和1 μL樣品；每個樣品重復(fù)3次。

3 結(jié)果與分析

3.116S rRNA基因的PCR擴增及序列比對結(jié)果

21種魚16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物大小為600 bp左右，條帶單一，可以很好地進行測序分析。測序產(chǎn)物經(jīng)Genbank數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果見表1。

表1　21種魚16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物測序比對結(jié)果

（續(xù)表1）

3.2細胞色素b基因的PCR擴增

21種魚類細胞色素b基因的PCR擴增結(jié)果均得到464bp大小的片段，條帶單一。

3.314種北方沿海經(jīng)濟魚種和7種鰈科魚類細胞色素b基因RFLP分析

14種魚類的PCR-RFLP酶切圖譜見圖1，共得到84個電泳條帶，片段大小見表2；7種鰈科魚類的PCR-RFLP酶切圖譜見圖2，共得到48個電泳條帶，片段大小見表3。D代表Dde I酶，H代表Hae III酶，N表示Nla III酶。結(jié)果顯示，只有3種酶的組合才可實現(xiàn)全部魚類的有效鑒別。試驗中所涉及魚類的酶切位點突變率低，在3次重復(fù)實驗中每個酶切片段僅相差2-5 bp。

圖1　14種海魚的PCR-RFLP芯片電泳圖譜

表2　14種海魚細胞色素b基因PCR擴增片段分別經(jīng)Dde I、Hae III和N la III酶切的片段大小

圖2　7種鰈魚PCR擴增片段分別經(jīng)Dde I、Hae III和Nla III酶切的RFLP片段大小

表37　種鰈魚PCR擴增片段分別經(jīng)Dde I、Hae III和Nla III酶切的RFLP片段大小

4 討論

本研究對21種魚類的16S rRNA基因進行了PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行了測序及同源性比對分析。良好匹配的可能性百分比為99%；如匹配未有良好，但其反應(yīng)類型足夠接近期望值，仍可清楚鑒定，可信限范圍為85%-99%，越接近99%越說明鑒定結(jié)果匹配。結(jié)果顯示，太平洋絨杜父魚的16S rRNA基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中的美洲絨杜父魚（Hemitripterus americanus）16S rRNA基因（GenBank登錄號：AF420458.1）的同源性最高，為94%。本研究所用杜父魚經(jīng)大連海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖中心鑒定為太平洋絨杜父魚，這一結(jié)果與Blast同源性比對結(jié)果并不一致，分析構(gòu)成這一矛盾的原因為GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有太平洋杜父魚16S rRNA基因的相關(guān)信息，故Blast同源比對結(jié)果顯示目標序列與同為絨杜父魚屬的美洲絨杜父魚16S序列相似度最高。美洲絨杜父魚分布于加拿大和美國東北海域［11］，而太平洋絨杜父魚主要分布于太平洋西北部沿海水體，在中國常見于大連和長島海域［12］，可見本研究最終鑒定結(jié)果與魚類地理分布事實相符。而其他20種魚類與GenBank數(shù)據(jù)庫中各自相應(yīng)序列的同源性比對結(jié)果均為98%以上。

5 結(jié)論

本研究將PCR-RFLP技術(shù)與芯片生物分析技術(shù)相結(jié)合，獲得了中國北方14種經(jīng)濟魚類和7種鰈魚的PCR-RFLP圖譜，所建立的方法重復(fù)性好、操作簡便、快速，為魚類的品種鑒定提供了理論參考。整個過程可以在一天內(nèi)完成，具有較高的推廣價值和應(yīng)用前景。

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The Application of PCR-RFLP to 14 Kinds of Economic Fish from North China Coastal and 7 Kinds of Pleuronectidae Fish

Yan Pingping1，Qi Xin1，Huang Daliang1*，Wang Haiyan2，Cui Yan1，Tian Zhuo1，Zhang Lirong1
（1.Dalian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian，Liaoning，116600；2.Dayaowan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureaus）

14 kinds of economic fish（Hyporhamphus sajori，Synechogobius ommaturus，Seriola lalandi，Platycephalus indicus，Hexagrammos otakii，Thamnaconus septentrionalis，Scophthalmus maximus，Chirolophis japonicus，Hemitripterus villosus，Gadus morhua，Zebrias zebrinus，Cynoglossus lighti，Pholis fangi，Paralichthys olivaceus）from North China coastal and 7 kinds of pleuronectidae fish（Hippoglossoides robustus，Limanda aspera，Atheresthes evermanni，Platichthys stellatus，Reinhardtius hippoglossoides，Pleuronichthys cornutus，Kareius bicoloratus）were the objects.First mitochondrial 16s rRNA gene was amplified and homologied of the sequence.Mitochondrial cytochrome b gene of the 21 kinds of fish was analyzed by PCR-RFLP.The diested DNA fragments were analyzed by microfluidic capillary electrophoresis.The total of 132 electrophoresis bandings were detected.The 21 kinds of fish species were fully discriminated.The results of this article provide a scientific basis for the fish species identification and fish food testing.

Economic Fish；Pleuronectidae；PCR-RFLP；16S rRNA；Cytochrome

Q959.4

E-mail：ppy1129@163.com；*通訊作者E-mail：ciqzhhdl@163.com

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2011IK119）

2015-07-08