吳方毅任妮麗

腫瘤壞死因子α與白介素17在銀屑病中的表達(dá)

吳方毅1任妮麗2*

目的： 檢測(cè)TNF-α與IL-17在銀屑病皮損中的表達(dá)。方法： ELISA檢測(cè)68例銀屑病患者與28例對(duì)照（非銀屑病患者）血清TNF-α和IL-17的表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)局部皮損、患者正常皮膚及對(duì)照者皮膚中TNF-α和IL-17的表達(dá)；qT-PCR檢測(cè)TNF-α和IL-17的mRNA表達(dá)。結(jié)果： 銀屑病患者血清TNF-α、IL-17的表達(dá)均高于對(duì)照組（P＜0.05）；皮損組織中TNF-α、IL-17蛋白及mRNA的表達(dá)均高于患者正常皮膚及對(duì)照組皮膚（均P＜0.05）。結(jié)論： TNF-α與IL-17在銀屑病的發(fā)展中可能相互作用。

TNF-α； IL-17； 銀屑病

銀屑病的發(fā)病率約1～5%，1，2銀屑病的病因還不完全清楚，普遍認(rèn)為是一種自身免疫性的炎性疾病。銀屑病的全基因組關(guān)聯(lián)已經(jīng)確定，這些關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)參與了皮膚的屏障功能（LCE3A，LCE3C和LCE3D）、T-細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（IL-2，IL-17，IL-21，IL-13，IL-12B，IL-23A，IL-23R等）和抗原提呈（ERAP1和HLA-C）。3，4在這些因子中，細(xì)胞因子白介素-17在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中具有至關(guān)重要的作用。銀屑病斑塊顯示活化的T細(xì)胞，特別是Th17型的浸潤(rùn)放大了炎性反應(yīng)，活化的T細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子包括IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-17，腫瘤壞死因子（TNF）-α，干擾素γ，表皮生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血小板介導(dǎo)的生長(zhǎng)因子。5TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在異常情況下，特別是其水平升高時(shí)會(huì)導(dǎo)致免疫病理反應(yīng)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病、炎性腸炎、克朗病等。新近研究發(fā)現(xiàn)，6銀屑病患者皮損、血清、關(guān)節(jié)腔滑膜或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的水平較正常對(duì)照組明顯升高，經(jīng)治療后會(huì)有不同程度的下降，且銀屑病患者病情嚴(yán)重程度與TNF-α的水平呈正相關(guān)，提示TNF-α在銀屑病發(fā)病機(jī)制中有重要作用。IL-17和TNF-α的組合表現(xiàn)出復(fù)雜的相互作用與增強(qiáng)基質(zhì)的形成，7堿性磷酸酶活性，并具有降低Schnurri-3表達(dá)的凈效應(yīng)。但兩者在銀屑病中的共表達(dá)及意義尚無(wú)相關(guān)研究。本文主要研究IL-17與TNF-α在銀屑病中的共表達(dá)及意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 TNF-α抗體購(gòu)自于 saierbio（貨號(hào)：ReSRP00068），IL-17抗體購(gòu)自于 BD（貨號(hào)：559501），IL-17A ELISA試劑盒購(gòu)自于Enzo（貨號(hào)：ADI-900-177），TNF-αELISA試劑盒購(gòu)自于Diaclone（貨號(hào)：950.090.048）

1.1.2標(biāo)本 收集我科2000-2013年經(jīng)病理證實(shí)為銀屑病的患者資料68例，其中男31例，女37例，年齡20～75歲，平均38歲，收集外周靜脈血液標(biāo)本，及背部或腹部破損的皮損組織（A組），取距皮損處大于12 cm的正常皮膚送檢作對(duì)照（B組）。同期我院整形美容科門診28例患者廢棄的正常皮膚作為正常皮膚對(duì)照（C組）。收集的皮膚做液氮冷凍保存。收集的銀屑病患者外周血液離心后取血清冷凍保存，同期體檢門診健康人群血常規(guī)血清液做健康對(duì)照。所有病例均有患者簽字的知情同意書和有創(chuàng)操作同意書。

1.2方法

1.2.1運(yùn)用ELISA檢測(cè)循環(huán)血中TNF-α/IL-17的表達(dá)水平，采用人血清TNF-αELISA試劑盒以及人血清IL-17 ELISA試劑盒，450 nm紫外線下檢測(cè)，8各種實(shí)驗(yàn)要求和步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，計(jì)算各樣本TNF-α/IL-17蛋白數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)，取得TNF-α/ IL-17蛋白的血漿濃度。

1.2.2Western檢測(cè)銀屑病患者局部皮損組織、皮旁組織及正常皮膚組織中的TNF-α/IL-17表達(dá)將皮膚組織收集到的勻漿液進(jìn)行免疫印記法9檢測(cè)。TNF-α/IL-17抗稀釋度分別為1∶400、1∶600。圖像分析系統(tǒng)掃描分析各條帶灰度值，結(jié)果取被檢條帶與內(nèi)參條帶的灰度值之比。

1.2.3運(yùn)用qT-PCR檢測(cè)銀屑病患者局部皮損組織、皮旁組織及對(duì)照皮膚組織中TNF-α/IL-17的mRNA表達(dá)水平，剪綠豆大皮損樣品，加入1 mL Trizol，勻漿器勻漿。加入200μL氯仿，輕輕顛倒數(shù)次混勻，室溫放置5 min，12 000 rpm 15 min 4℃。轉(zhuǎn)上層水相（約400μL）于新1.5 mL EP管中，加入400μL異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，12 000 rpm 10min 4℃。棄上清，沉淀用預(yù)冷的70%無(wú)水乙醇洗3次，空氣干燥5～10 min，溶于20μL DEPC水中。分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。將所得到的cDNA做10倍稀釋，取4μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，10Green/Flouresceinq PCR Master Mix（2X）10μL，H2O 5.2μL；DL2000：2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；Cycling conditions，40 cycles of 95℃-30 s，60℃-30 s。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1：

表1　小鼠肺腺癌組織中ERβ、ERβ2和IGF-1R的FQ-PCR引物序列

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件。使用卡方檢驗(yàn)分析TNF-α和IL-17在銀屑病患者及對(duì)照組中表達(dá)的差異。銀屑病患者血液及皮損組織中TNF-α和IL-17之間進(jìn)行表達(dá)相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1銀屑病患者與健康人群循環(huán)血中TNF-α/IL-17表達(dá)水平的比較 采用ELISA試劑盒檢測(cè)銀屑病患者與健康人群循環(huán)血中TNF-α/IL-17表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TNF-α/IL-17在銀屑病患者血液中的表達(dá)均高于健康人群（表2，圖1），表明TNF-α/IL-17在銀屑病患者血液中存在共同高表達(dá)現(xiàn)象。

表2　不同人群TNF-α/IL-17表達(dá)水平的比較

圖1　不同人群血液中TNF-α/IL-17表達(dá)的比較

2.2局部皮損組織、皮損旁組織及健康皮膚組織中的TNF-α/IL-17表達(dá) 運(yùn)用Western-blot檢測(cè)局部皮損組織、皮損旁組織及健康皮膚組織中的TNF-α/ IL-17表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TNF-α/IL-17蛋白水平在皮損組織中顯著高于皮損旁組織及健康皮膚組織（均P＜0.05），對(duì)照組與皮旁組織無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明TNF-α/IL-17存在相互作用的分子基礎(chǔ)，在銀屑病中炎癥因子與TNF-α可能存在協(xié)同促進(jìn)作用，見(jiàn)圖2。

圖2　不同人群不同組織TNF-α/IL-17蛋白水平的比較

2.3局部皮損組織、皮損旁組織及健康皮膚組織中的TNF-α/IL-17 mRNA的表達(dá) 為了在mRNA水平進(jìn)一步研究局部皮損組織、皮損旁組織及健康皮膚組織中的TNF-α/IL-17表達(dá)，我們所取得的標(biāo)本做TNF-α/IL-17的FQ-PCR分析。FQ-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α/IL-17分別在其局部皮損組織顯著高于對(duì)照組和皮損旁組織（P＜0.05），對(duì)照組與皮旁組織無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些表達(dá)趨勢(shì)與蛋白水平相一致，進(jìn)一步表明TNF-α/IL-17存在相互作用的分子基礎(chǔ)，見(jiàn)圖3。

圖3　不同人群不同組織TNF-α/IL-17 mRNA水平的比較（2-△△t=△t=實(shí)驗(yàn)組含量-內(nèi)參含量；△△t為平均值，例如△△t（IL-8）=△t（IL-8）-△t（對(duì)照組）；2-△△t平均值=2-△△t，即2-△△t的平均值）

3　討論

白細(xì)胞介素-17（IL-17A）屬于六配位成員（IL-17A和IL-17F）促炎細(xì)胞因子，IL-17是該系列的原型。這種二聚體糖蛋白在循環(huán)中存在同型二聚體IL -17A或異源二聚體IL-17F。11-13在銀屑病的發(fā)病機(jī)制研究中，無(wú)論是先天還是后天性免疫系統(tǒng)中所涉及的銀屑病，過(guò)度增殖角質(zhì)形成細(xì)胞是通過(guò)從T細(xì)胞的細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的，產(chǎn)生進(jìn)一步的促炎性細(xì)胞因子。銀屑病斑塊顯示活化的T細(xì)胞，特別是Th17細(xì)胞的浸潤(rùn)放大炎性反應(yīng)，產(chǎn)生大量的IFN-γ，IL-17，IL-22和TNF-α。這顯示出IL-17和TNF-α均在銀屑病中具有重要作用。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者循環(huán)血液中IL-17和TNF-α均高于對(duì)照組，并且在蛋白水平和mRNA水平同樣顯示出局部皮損組織中均高于皮旁組織及正常皮膚組織，說(shuō)明IL-17和TNF-α在銀屑病患者有顯著高表達(dá)現(xiàn)象。一個(gè)更加關(guān)鍵的報(bào)道是14TNF-α抑制BMP2表達(dá)時(shí)增強(qiáng)了IL-17的分泌。TNF-α與IL-17共同激活NF-κB和AP-1，15，16IL-17上的hMSCs增加TNF-α的作用效率，14為此我們推測(cè)在銀屑病中可能也存在這種交叉反應(yīng)。

初步實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)IL-17和TNF-α在銀屑病中均顯著高表達(dá)，這表明兩信號(hào)通路存在相互作用的分子基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步研究IL-17和TNF-α在銀屑病中是否具有相互作用，我們對(duì)比銀屑病患者循環(huán)血液中IL-17和TNF-α的表達(dá)，并進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)具有相關(guān)性。在后續(xù)的免疫印跡實(shí)驗(yàn)和qT-PCR實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)IL-17和TNF-α在銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)具有相關(guān)性，并且在局部皮損組織、皮旁組織及對(duì)照皮膚組織中表現(xiàn)出明顯的梯度趨勢(shì)。這些結(jié)果表明IL-17和TNF-α在銀屑病進(jìn)展中可能存在相互作用。

綜上所述，本文初步探討了銀屑病患者循環(huán)血液及局部皮損組織中TNF-α/IL-17的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TNF-α/IL-17在銀屑病患者顯著高表達(dá)，且兩者具有共表達(dá)趨勢(shì)；TNF-α/IL-17在銀屑病的進(jìn)展中可能存在相互作用。由于本文只是初步探討TNF-α/IL-17的表達(dá)，為研究?jī)烧咴阢y屑病中相互作用的分子基礎(chǔ)提供理論依據(jù)，盡管結(jié)果表明TNF-α/IL-17兩信號(hào)通路可能存在相互作用，但是還不足以證實(shí)，這有待于下一步的深入研究，其結(jié)果可能為銀屑病的多靶點(diǎn)聯(lián)合治療提供新的選擇。

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（收稿：2015-01-19）

·病例報(bào)告·

The common expression of TNF-αand IL-17 in psoriasis and its significance

WU Fang-yi，REN Ni-li.Department ofDermatology，Shiyan People'sHospital，Affiliated to Hubei University ofMedicine，Shiyan，442000

Objective：To detect the expression of TNF-αand IL-17 in the patientswith psoriasis.M ethods：The serum levels of TNF-αand IL-17 were detected in 68 patients with psoriasis and 28 controls from cosmetic surgery department.The expression of protein TNF-αand IL-17 in the patients'lesions and normal skin of the patients aswell as the skin of normal controlswas detected by ELISA and themRNA of TNF-αand IL-17 was detected by qT-PCR.Results：The levels of serum TNF-αand IL-17 were higher in the patients than in controls.The levels of protein and mRNA expression of TNF-αand IL-17 were higher in the patients' lesions than in thenormalskin of the patientsand controls.Conclusion：TNF-αand IL-17may be interacted in the progress of psoriasis.

TNF-α；IL-17；psoriasis

1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院皮膚科，十堰，442000

2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，442000