肖　楓，朱文學(xué)*，康懷彬，劉莉麗，賀家亮，任國艷

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽　471023）

黃河鯉魚鱗明膠消化過程中的抗氧化活性

肖楓，朱文學(xué)*，康懷彬，劉莉麗，賀家亮，任國艷

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽471023）

為探索黃河鯉魚鱗明膠在體內(nèi)的消化特性，在37 ℃條件下，先采用胃蛋白酶對黃河鯉魚鱗明膠酶解2 h（pH 2.0），隨后調(diào)整pH值至7.5，采用胰蛋白酶對其酶解2 h，考察黃河鯉魚鱗明膠在模擬消化過程中的水解度變化規(guī)律。采用體外抗氧化模型考察了黃河鯉魚鱗明膠在模擬消化過程中的羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力、總還原力、脂質(zhì)氧化抑制能力和金屬離子螯合能力等抗氧化活性。結(jié)果表明，胃蛋白酶對黃河鯉魚鱗明膠的消化能力較差，對其α鏈和β鏈的酶解作用較弱，而胰蛋白酶對黃河鯉魚鱗明膠肽鏈有較強的酶解作用，黃河鯉魚鱗明膠經(jīng)模擬消化后水解度可達到16.9%，消化產(chǎn)物的抗氧化性能與其消化過程中水解度有較強的相關(guān)性。

黃河鯉魚鱗；明膠；模擬消化；抗氧化

多種代謝途徑都會產(chǎn)生自由基，機體內(nèi)自由基過多會造成生物大分子的損傷［1］。食源性抗氧化物質(zhì)協(xié)同內(nèi)源性抗氧化成分能夠有效阻斷和消除各種氧化損傷。目前研究者已從多種動植物體中分離出具有抗氧化活性的天然活性物質(zhì)，包括多糖［2-3］、多酚類［4-5］以及蛋白質(zhì)和多肽［6-8］類等?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物多以小肽而不是游離氨基酸的形式被胃腸道吸收［9］，且腸道對小肽的吸收代謝速率較氨基酸分子更快［10］。魚鱗中膠原蛋白含量較為豐富，以魚鱗提取膠原蛋白或明膠，既能減輕環(huán)境污染，又充分利用了魚鱗資源，達到了淡水魚的綜合利用目的。

采用單酶或復(fù)合酶對食物蛋白質(zhì)進行酶解，可以制備具有各種生物活性的寡肽，研究表明，以多種水產(chǎn)動物蛋白為原料制備的肽類物質(zhì)具有抗氧化活性，其中，以水產(chǎn)膠原蛋白為原料制備各種生物活性肽已廣受關(guān)注［11-14］，有關(guān)黃河鯉魚鱗明膠肽的研究尚未見報道。目前，有關(guān)膠原或明膠肽的研究主要包括：蛋白質(zhì)的酶解工藝、生物活性的篩選、目標(biāo)組分的分離純化和理化特性等方面，但關(guān)于黃河鯉魚明膠消化性及消化產(chǎn)物的活性方面還未見報道。食源性生物活性肽的活性檢測和篩選通常選用體外模型進行實驗，但是，目標(biāo)產(chǎn)物在體內(nèi)消化系統(tǒng)中可能會發(fā)生進一步酶解，從而造成其活性的喪失，使得體外實驗的結(jié)果與其在體內(nèi)的活性沒有相關(guān)性，如果直接采用消化酶模擬消化環(huán)境對蛋白質(zhì)進行酶解，則體外實驗檢測結(jié)果能夠反映其在生物體內(nèi)的作用。本實驗以黃河鯉魚鱗明膠（scale gelatin from the Yellow River carp，YSG）為原料，模擬體內(nèi)的消化環(huán)境，研究消化酶對黃河鯉魚鱗明膠的消化能力，采用體外抗氧化活性的檢測方法研究黃河鯉魚鱗明膠在模擬消化過程中消化產(chǎn)物的抗氧化活性，以期為黃河鯉魚鱗明膠肽的開發(fā)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

黃河鯉魚鱗明膠河南科技大學(xué)食品學(xué)院的專業(yè)實驗室制備。

胃蛋白酶、胰蛋白酶、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

722N型分光光度計上海精密科學(xué)儀器有限公司；Fs4111型電子分析天平上海衡平儀器儀表廠；HR152型電熱恒溫水浴鍋金壇市晶玻實驗儀器廠；NS-100B恒溫?fù)u床上海皓莊儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1黃河鯉魚鱗明膠的模擬消化

參考You Lijun等［15］的方法，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬胃腸道消化。配制黃河鯉魚鱗明膠溶液（15 g/L），調(diào)pH值至2.0，加入質(zhì)量濃度4 g/100 mL的胃蛋白酶，37 ℃酶解2 h。然后調(diào)節(jié)pH 7.5，加入4 g/100 mL的胰蛋白酶，37 ℃酶解2 h。每隔0.5 h取樣品測定消化產(chǎn)物的水解度和抗氧化活性。

1.2.2水解度的測定

采用茚三酮比色法測定，以被水解的肽鍵數(shù)目占膠原蛋白中總肽鍵數(shù)的百分?jǐn)?shù)來表示明膠的水解度。

式中：h為被裂解的肽鍵數(shù)；H為膠原蛋白的總肽鍵數(shù)。

1.2.3羥自由基（·OH）清除能力的測定

采用鄰二氮菲法測定消化產(chǎn)物的·OH清除能力［15］。吸取鄰二氮菲溶液（5.0 mmol/L）、FeSO4溶液（5.0 mmol/L）和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液（15 mmol/L）各600 μL，與400 μL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4）混合均勻，加入消化液600 μL和0.01%的H2O2溶液800 μL，混合液置于37 ℃條件下反應(yīng)60 min，在536 nm波長處測定混合液的吸光度。按下式計算·OH清除率。

式中：As為加入樣品溶液后的吸光度；Ac為對照組（以蒸餾水代替H2O2）的吸光度；A0為空白組（以蒸餾水代替樣品液）的吸光度。

1.2.4超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定消化產(chǎn)物的O2-·清除能力［16］。吸取50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2，含1 mmol/L的EDTA）3 mL，分別加入樣品溶液1 mL和濃度為25 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.5 mL，迅速混合、搖勻，在4 min內(nèi)，于波長420 nm波長處每隔30 s測定一次反應(yīng)液的吸光度，計算反應(yīng)液吸光度的變化率（As）。以1 mL蒸餾水代替樣品，測定空白對照液吸光度的變化率（Ac）。按下式計算O2-·清除率。

1.2.5DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻［15］方法，取一定質(zhì)量濃度的黃河鯉魚鱗明膠消化液2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH-甲醇溶液2 mL，混合均勻后避光放置30 min，然后測定混合液的吸光度，測定波長為517 nm。同時作空白（相同體積的甲醇和蒸餾水混合）和對照（以蒸餾水代替樣品）實驗。按下式計算DPPH自由基清除率。

式中：As為加入樣品溶液后的吸光度；A0為空白液的吸光度。

1.2.6總還原力的測定

參考You Lijun等［15］的方法測定黃河鯉魚鱗明膠消化產(chǎn)物的總還原力，取2.0 mL消化液，添加磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）和鐵氰化鉀溶液（0.01 g/mL）各2.0 mL，將混合液置于50 ℃溫度條件下保持20 min，加入2.0 mL三氯乙酸溶液（0.1 g/mL），混勻后在3 000 r/min的條件下離心10 min。取上清液2 mL，加入0.4 mL FeCl3溶液（0.01 g/mL）和2 mL蒸餾水，混合均勻，在室溫條件下靜置10 min，測定該混合液在700 nm波長處的吸光度，以吸光度來反映其總還原力，吸光度越大則表示試樣的總還原力越強。

1.2.7脂質(zhì)氧化抑制能力的測定

采用硫氰酸銨比色法測定黃河鯉魚鱗明膠消化產(chǎn)物的脂質(zhì)氧化抑制率［15］，在50 mL錐形瓶中加入2.0 mL消化液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的亞油酸溶液2.0 mL混勻，然后加入4 mL磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.0）和2 mL蒸餾水，將反應(yīng)液置于40 ℃培養(yǎng)箱中保溫48 h。亞油酸的氧化測定方法為：將0.1 mL反應(yīng)液與9.7 mL的75%的乙醇溶液混合，再添加30 g/100 mL的硫氰酸銨和0.02 mol/L FeCl2溶液各0.1 mL，充分混勻，3 min后測定混合液在500 nm波長處的吸光度。用相同體積蒸餾水代替反應(yīng)液作為空白。按下式計算脂質(zhì)氧化抑制率。

式中：As，48h為消化液在反應(yīng)48 h的吸光度；As，0h為消化液在反應(yīng)0 h的吸光度；A0，48h為未加樣品的空白組在反應(yīng)48 h的吸光度；A0，0h為未加樣品的空白組在反應(yīng)0 h的吸光度。

1.2.8金屬離子螯合能力的測定

參考You Lijun等［15］的方法測定黃河鯉魚鱗明膠消化產(chǎn)物的Cu2+螯合能力，取CuSO4溶液（2 mmol/L）1 mL與吡啶溶液（pH 7.0）1 mL和鄰苯二酚紫（質(zhì)量濃度0.1 g/100 mL）溶液20 μL混合，加入消化液樣品1 mL，反應(yīng)5 min后，在632 nm波長處測定反應(yīng)液的吸光度。以相同體積的蒸餾水代替消化液樣品作為空白對照，Cu2+螯合能力用下式進行計算。

式中：As為加入樣品反應(yīng)液的吸光度；A0為空白組的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1黃河鯉魚鱗明膠消化過程中水解度的變化

圖1　黃河鯉魚鱗明膠在體外模擬消化過程中水解度的變化Fig.1　Change in DH during sequential in vitro digestion of YSG

黃河鯉魚鱗明膠在模擬消化過程中水解度的變化如圖1所示，在消化初期（0～2 h內(nèi)），水解度隨消化時間的延長稍有增加（P＞0.05）。通常構(gòu)成膠原蛋白的α鏈包括N端肽（11～19 個氨基酸殘基）、三股螺旋區(qū)（1 014～1 029 個氨基酸殘基）和C端肽（11～17 個氨基酸殘基）［17］，胃蛋白酶能夠破壞膠原蛋白端肽的交聯(lián)區(qū)，但不會損壞膠原蛋白三螺旋的完整性［18-19］。膠原蛋白經(jīng)熱處理轉(zhuǎn)變成明膠的過程中會產(chǎn)生α鏈單鏈和β鏈［20］，但在胃蛋白酶作用2 h后，魚鱗明膠的水解度僅達到（2.6±0.3）%，說明胃蛋白酶對膠原α鏈和β鏈不具有水解作用，或水解作用很小。進一步用胰蛋白酶處理的過程中（2～4 h），魚鱗明膠的水解度從（2.6±0.3）%顯著增加到（16.9±0.7）%（P＜0.05），說明胰蛋白酶對黃河鯉魚鱗明膠有較強的酶解作用，能夠切斷膠原肽鏈，將其分解為較小分子質(zhì)量的肽。

2.2黃河鯉魚鱗明膠消化過程中的·OH清除能力

在幾種氧自由基中，·OH具有最強的氧化能力，能夠與生物大分子作用，對·OH的清除可能是機體抵抗疾病的最有效方法［15］。肽類物質(zhì)的抗氧化性能與其氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和分子疏水性等因素有關(guān)，其中Tyr、Trp、Met、Lys、Cys和His等是提供抗氧化能力的代表性氨基酸［21］。而具有芳香基團的氨基酸能夠作為氫供體，從而提高氨基酸殘基的自由基清除能力，適當(dāng)?shù)陌被峤M成及其在肽鏈中的位置，以及肽鏈的構(gòu)象都是影響肽類物質(zhì)抗氧化性能的重要因素［22］。黃河鯉魚鱗明膠在消化過程中的·OH清除能力如圖2所示。胃蛋白酶消化過程中，·OH的清除率緩慢增加到（14.5±1.8）%（P＞0.05），然而，進一步采用胰蛋白酶消化后，其·OH清除率顯著提高到（45.6±2.3）%（P＜0.05）。黃河鯉魚鱗明膠消化過程中·OH清除能力與其水解度的變化呈相似的趨勢，表明其經(jīng)過胰蛋白酶水解后產(chǎn)生小分子肽，具有氫或電子供體能力，表現(xiàn)出·OH清除活性。蛋白質(zhì)的水解度、水解酶的種類、水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量等都會影響其抗氧化性能。如谷蛋白水解產(chǎn)物中，分子質(zhì)量為500～1 500 D的組分具有最強的抗氧化性能，而分子質(zhì)量低于500 D和高于1 500 D組分的抗氧化性能則較弱［23］。通常認(rèn)為肽類物質(zhì)的總體抗氧化性能歸因于 各組分的綜合效應(yīng)，而不是單個成分的個體效應(yīng)［24］。

圖2　黃河鯉魚鱗明膠在體外模擬消化過程中·OH清除能力的變化Fig.2　Change in hydroxyl radical scavenging activity of YSG during sequential in vitro digestion

2.3黃河鯉魚鱗明膠消化過程中的O2-·清除能力

大量生物反應(yīng)可產(chǎn)生O2-·，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生·OH等強氧化性自由基，因此，O2-·的清除能力對于抗氧化劑的抗氧化能力非常重要［21］。黃河鯉魚鱗明膠在消化過程中的O2-·清除能力如圖3所示，在胃蛋白酶的消化過程中，消化產(chǎn)物對O2-·的清除率緩慢增加到（11.5±1.8）%（P＞0.05），進一步采用胰蛋白酶消化后，消化產(chǎn)物的O2-·清除率升高到（34.2±2.3）%（P＜0.05），表明較小分子的黃河鯉魚鱗明膠肽具有更強的O2-·清除能力。

圖3　黃河鯉魚鱗明膠在體外模擬消化過程中的OO2-·清除能力Fig.3　Change in superoxide anion radical scavenging activity of YSG during sequential in vitro digestion

2.4黃河鯉魚鱗明膠消化過程中的DPPH自由基清除能力

圖4　黃河鯉魚鱗明膠在體外模擬消化過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.4　Change in DPPH radical scavenging activity of YSG during sequential in vitro digestion

黃河鯉魚鱗明膠在模擬消化過程中對DPPH自由基清除能力的變化如圖4所示，黃河鯉魚鱗明膠在消化0.5 h后對DPPH自由基的清除率提高到（9.5±1.2）%（P＜0.05），胃蛋白酶繼續(xù)消化后，DPPH自由基清除率緩慢提高到（10.8±0.9）%（P＞0.05）。在胰蛋白酶的消化過程中，消化產(chǎn)物在胰蛋白酶消化1 h時達到最大的DPPH自由基清除率（15.5±0.9）%。蛋白質(zhì)在消化過程中DPPH自由基清除能力提高，是因為蛋白質(zhì)中肽鍵的斷裂，一些疏水性氨基酸殘基暴露出來［15］，更利于肽分子與DPPH自由基的接觸，進而使得它們更容易捕捉到DPPH自由基，而過長時間的酶處理過程中，隨著蛋白質(zhì)水解度的增加，水解產(chǎn)物中短鏈的肽及游離氨基酸的含量增加，使得消化產(chǎn)物的親水性增強。極性的增加會導(dǎo)致消化產(chǎn)物難以與脂溶性DPPH自由基發(fā)生反應(yīng)［12］。因此，在胰蛋白酶消化1 h后，消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力下降。

2.5黃河鯉魚鱗明膠消化過程中的總還原力

還原力是預(yù)測物質(zhì)抗氧化能力的一個重要指標(biāo)，它反映了抗氧化物質(zhì)提供電子或氫原子的能力。黃河鯉魚鱗明膠在模擬消化過程中總還原力的變化如圖5所示，胃蛋白酶處理1 h后吸光度升高到0.407±0.032，消化液的總還原力顯著提高（P＜0.05），而在胃蛋白酶繼續(xù)消化的過程中，其總還原力沒有顯著變化（P＞0.05）。進一步采用胰蛋白酶對其進行消化處理的過程中，消化產(chǎn)物的總還原力隨其消化時間延長而逐漸提高，在胰蛋白酶消化1.5 h后吸光度顯著增加到0.657±0.021（P＜0.05），隨后，消化產(chǎn)物的總還原力隨消化時間延長緩慢增加。

圖5　黃河鯉魚鱗明膠在體外模擬消化過程中總還原力的變化Fig.5　Change in reducing power of YSG d　uring sequential in vitro digestion

2.6黃河鯉魚鱗明膠消化過程中的脂質(zhì)氧化抑制能力

圖6　黃河鯉魚鱗明膠在體外模擬消化過程中脂質(zhì)氧化抑制能力的變化Fig.6　Change in lipid peroxidation inhibitory activity of YSG during sequential in vitro digestion

脂質(zhì)的氧化通常被認(rèn)為是一種經(jīng)自由基介導(dǎo)的氧化反應(yīng)，在此過程中多不飽和脂肪酸分子中亞甲基碳上的氫原子被自由基獲?。?5］。黃河鯉魚鱗明膠在模擬消化過程中脂質(zhì)氧化抑制能力的變化如圖6所示，在胃蛋白酶消化過程中，消化液的脂質(zhì)氧化抑制能力沒有顯著變化（P＞0.05），其脂質(zhì)氧化抑制率從（7.2±0.7）%提高到（12.3±0.6）%。在胰蛋白酶消化1.5 h后，消化液的脂質(zhì)氧化抑制率顯著提高到（47.5±1.1）%，然而，繼續(xù)延長胰蛋白酶的處理時間對其脂質(zhì)氧化抑制率沒有顯著影響（P＞0.05）。消化過程中的脂質(zhì)氧化抑制率與其水解度的變化趨勢相似，表明隨著水解度的提高，更多具有自由基清除能力的小肽分子被釋放出來，與脂質(zhì)體系中的自由基結(jié)合，從而表現(xiàn)出更強的脂質(zhì)氧化抑制作用。

2.7黃河鯉魚鱗明膠消化過程中的金屬離子螯合能力

圖7　黃河鯉魚鱗明膠在體外模擬消化過程中金屬離子螯合能力的變化Fig.7　Change in metal chelating activity of YSG during sequential in vitro digestion

如圖7所示，隨著消化時間的延長，消化液的Cu2+螯合能力逐漸增強，與水解度的變化趨勢相似，表明消化產(chǎn)物中分子質(zhì)量較小的肽具有更強的Cu2+螯合能力。一些金屬離子如Fe2+、Cu2+等在脂類物質(zhì)的氧化過程中具有催化作用，因此，將脂質(zhì)反應(yīng)體系中的Fe2+、Cu2+等螯合可以間接地抑制脂類物質(zhì)的氧化，對金屬離子的螯合能力也體現(xiàn)該物質(zhì)具有一定的抗氧化能力。

3　結(jié) 論

胃消化階段對黃河鯉魚鱗明膠的α鏈和β鏈不具有水解作用，或者水解能力較弱，而腸消化階段對魚鱗明膠肽鏈有較強的酶解作用，魚鱗明膠經(jīng)消化后水解度可到達16.9%。

黃河鯉魚鱗明膠在腸消化階段能夠產(chǎn)生抗氧化活性肽，消化產(chǎn)物的·OH、O2-·清除能力和總還原力隨其水解程度增加而增強，消化產(chǎn)物的脂質(zhì)氧化抑制能力和金屬離子螯合能力具有相似的變化趨勢，一些金屬離子在脂類物質(zhì)的氧化過程中具有催化作用，因此，將脂質(zhì)反應(yīng)體系中的Fe2+、Cu2+等螯合可以間接地抑制脂類物質(zhì)的氧化。

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Changes in Antioxidant Activity of Gelatin Hydrolysates from Yellow River Carp （Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel） Scale during Simulated Gastrointestinal Digestion

XIAO Feng， ZHU Wenxue*， KANG Huaibin， LIU Lili， HE Jialiang， REN Guoyan
（School of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang471023， China）

In order to explore the in vivo digestion properties of scale gelatin from the Yellow River carp Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel ， a two-stage in vitro digestion model system （sequential treatment with pepsin for 2 h at pH 2.0 followed by pancreatin for 2 h at pH 7.5） was used to simulate the process of human gastrointestinal （GI）digestion to determine the digestibility of fish scale gelatin at 37 ℃. The change in hydrolysis degree of Yellow River carp scale gelatin （YSG） during simulated GI digestion was studied and its antioxidant activities （hydroxyl， superoxide and DPPH free radical scavenging capacities， reducing power， lipid peroxidation inhibition activity， and metal chelating activity） were investigated through in vitro models. The results showed very low digestive power of pepsin on the α chain and β chain of YSG compared with pancreatin. The final degree of hydrolysis from GI digestion was 16.9%. The antioxidant activity of fish scale gelatin was correlated with the degree of hydrolysis.

Cyprinus carpio haematopterus scale； gelatin； simulated digestion； antioxidant activity

TS254.9

A

1002-6630（2015）23-0116-05

10.7506/spkx1002-6630-201523022

2015-01-15

肖楓（1979—），男，講師，博士，研究方向為水產(chǎn)品綜合利用。E-mail：xfeng@haust.edu.cn

朱文學(xué)（1967—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品干燥和農(nóng)產(chǎn)品功能性成分分離、提取及活性。E-mail：zwx@haust.edu.cn