烏云達(dá)來，張博潤(rùn)，郭雪娜，王肇悅，*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

生物合成γ-氨基丁酸釀酒酵母谷氨酸脫羧酶基因的克隆與表達(dá)

烏云達(dá)來1，2，張博潤(rùn)2，郭雪娜2，王肇悅2，*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

為了提高酵母菌的γ-氨基丁酸產(chǎn)量，本研究以十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyl trimethy ammonium bromide，CTAB）提取的釀酒酵母28基因組DNA為模板，擴(kuò)增 得到序列長(zhǎng)度為1 758 bp的GAD1基因，經(jīng)比對(duì)與S. cerevisiae S288c的一致性達(dá)到98.58%，并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包括GAD1基因上游啟動(dòng)子及調(diào)控序列，下游終止子在內(nèi)的全長(zhǎng)基因序列，長(zhǎng)度為3 490 bp。將全長(zhǎng)基因序列克隆至高拷貝質(zhì)粒pUG6，構(gòu)建重組質(zhì)粒p28。以菌株28作為出發(fā)菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)G418抗性篩選得到轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，質(zhì)粒提取及酶切驗(yàn)證，確證得到重組子DL28。經(jīng)重組質(zhì)粒p28的特性研究得知，重組質(zhì)粒p28具有良好的遺傳穩(wěn)定性，無抗性傳代培養(yǎng)10 次重組質(zhì)粒不丟失。轉(zhuǎn)化后進(jìn)行酶活力測(cè)定，重組子DL28的谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）酶活力比菌株28提高73.8%。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論，GAD基因高表達(dá)菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。

釀酒酵母菌；γ-氨基丁酸；谷氨酸脫羧酶；克隆；表達(dá)

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又名4-氨基丁酸和氨酪酸，廣泛存在于 從單細(xì)胞生物到哺乳動(dòng)物的各種有機(jī)體活細(xì)胞中［1］，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［2］，具有許多重要的生理功能，如降血壓［3］、治療哮喘［4］、促進(jìn)睡眠［5］、鎮(zhèn)痛［6］、抗衰老［7］、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌［8］等，因此日益受到人們的關(guān)注，并作為一種功能性因子越來越廣泛地用于食品、醫(yī)藥及化工等行業(yè)。獲得GABA的方法有化學(xué)合成法和生物合成法?；瘜W(xué)合成反應(yīng)劇烈、得率低、副產(chǎn)物多，難以純化，產(chǎn)物缺乏安全性，不適宜作為食品添加劑，生物合成法包括植物富集法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法具有安全、成本低、速度快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、分布廣等特點(diǎn)，因此以生物合成生產(chǎn)食品或醫(yī)藥級(jí)GABA是個(gè)理想的途徑，尤其是利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA逐漸成為研究熱點(diǎn)［9-13］。

谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）是生物體催化L-谷氨酸或鈉鹽脫羧反應(yīng)生成非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸GABA的唯一酶［14］，該酶已在多種生物中發(fā)現(xiàn)，可在合成GABA的微生物中，人們對(duì)大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶的研究最深入，但將大腸桿菌應(yīng)用于食品生產(chǎn)存在潛在的安全威脅［15］。然而利用乳酸菌、酵母菌、霉菌等微生物通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA或富含GABA的食品，具有不受資源、環(huán)境和空間的限制等顯著優(yōu)點(diǎn)。為了檢測(cè)和提高酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA的產(chǎn)量，本研究對(duì)產(chǎn)GABA的釀酒酵母GAD1基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，并且對(duì)重組質(zhì)粒特性和重組子進(jìn)行研究，為構(gòu)建高效表達(dá)GABA的酵母工程菌提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

E. co li DH5α ［supE44 Δ lacU169（φ 80 lacZ ΔM15）hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1］用于質(zhì)粒的構(gòu)建；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）28［16］、質(zhì)粒pUG6含有遺傳霉素抗性基因（KanMX和AmpR）的酵母菌-細(xì)菌穿梭質(zhì)粒［17］由中國科學(xué)院微生物研究所工業(yè)微生物與生物技術(shù)研究室提供。

1.1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

E. coli DH5α保存和培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子用含有200 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基；酵母菌保存和培養(yǎng)用YEPD培養(yǎng)基，酵母菌重組子篩選用含有200 μg/mL氨芐青霉素的YEPD培養(yǎng)基。

1.1.3酶和試劑

實(shí)驗(yàn)所用限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和Pfu Mix產(chǎn)品 寶生物工程（大連）有限公司；麥角甾醇 美國Sigma公司；溶菌酶、RNase和氨 芐青霉素 華美生物工程有限公司。

1.1.4儀器與設(shè)備

5415R型高速冷凍離心機(jī)、5804R型高速冷凍離心機(jī)、Mastercycler pro S型PCR儀 德國Eppendorf公司；Bio-Rad micropulser型電轉(zhuǎn)化儀、Bio-Rad Power Pac Basic型電泳儀 美國Bio-Rad公司；UV-2450型分光光度計(jì)日本島津公司；Tanon 4500型凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.2DNA操作

大腸桿菌感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒的提取參照文獻(xiàn)［18］進(jìn)行。酵母菌染色體DNA的制備及酵母菌的轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)［19］進(jìn)行。

1.3引物設(shè)計(jì)與GAD1基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中釀酒酵母GAD1基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物P1：5'-ACGCGTCGACATGTTACA CAGGCACGGTTCTAAGCAGAAG-3'和P2：5'-CCGCT CGAGTCAACATGTTCCTCTATAGTTTCTC-3'，以釀酒酵母28的基因組DNA為模板，進(jìn)行高保真的PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃總延伸10 min，于4 ℃保存。

1.4目的基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中釀酒酵母S288c（登錄號(hào)：NM001182756）基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物P1：5'-ACGCGTCGACATGTTACACAGGCACGGTTCT A AGCAGAAG-3'和P2：5'-CCGCTCTAGATCAAC ATGTTCCTCTATAGTTTCTC-3'，分別引入PvuⅡ和BglⅡ的識(shí)別位點(diǎn)（用下劃線標(biāo)出）。以釀酒酵母28的基因組DNA為模板，進(jìn)行高保真的PCR擴(kuò)增目的基因（GAD全長(zhǎng)序列），包括GAD基因上游啟動(dòng)子及調(diào)控序列，下游終止子。

1.5重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

純化后的目的基因片段與質(zhì)粒pUG6經(jīng)PvuⅡ和BglⅡ雙酶切后用T4 DNA連接酶37 ℃連接2 h，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的YEPD平板，30 ℃培養(yǎng)。次日挑取單菌落增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行單酶切（PvuⅡ）和雙酶切（BglⅡ和EcoRⅤ）及測(cè)序鑒定，將陽性重組質(zhì)粒命名為p28。

1.6重組質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化

將純化的重組質(zhì)粒p28與S. cerevisiae 28電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞混勻后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，電擊參數(shù)：1.5 kV、25 ?F、200 Ω、4.98 mS。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定，將獲得的陽性重組子命名為DL28。

1.7谷氨酸脫羧酶活性測(cè)定

1.7.1GAD酶液的制備

將GAD酶液的制備方法根據(jù)參考文獻(xiàn)［20］進(jìn)行，即將S. cerevisiae 28和重組子DL28（傳代10 次的末次培養(yǎng)物）的濕菌體3.0 g分別懸浮到30 mL pH 5.0的0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液中，內(nèi)含0.01 mmol/L 5'-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5'-phosphate hydrate，PLP），1 mmol/L二硫蘇糖醇，冰浴中超聲波破碎（400 W，工作5 s，間隔15 s，全程90 min），4 ℃放置過夜，4 ℃離心收集上清液（8 000×g，20 min），作為GAD溶液。

1.7.2GAD活力測(cè)定［21］

GAD酶液的反應(yīng)體系總體積為400 μL，其中GAD酶液100 μL，L-谷氨酸溶液（pH 4.5，40 mmol/L，含0.02 mmol/L PLP）100 μL，pH 4.5的0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液200 μL?；旌虾笥?0 ℃反應(yīng)4 h，加入4 倍體積預(yù)冷的-20 ℃無水乙醇終止反應(yīng)，然后參照文獻(xiàn)［22］方法測(cè)定GABA含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用SAS 9.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在測(cè)定條件下將1 min生成1 μmol GABA所需酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.8重組子質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

1.8.1重組子質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)中質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性測(cè)定方法［23］，并作適當(dāng)修改。將重組子DL28按1%體積比例接種于3 mL YEPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h；每隔12 h傳代一次，進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)10 次；利用重組質(zhì)粒p28中含有G418抗性基因的特性，每傳代一次進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)定；質(zhì)粒穩(wěn)定性等于從不含G418的平板上選取100 個(gè)單菌落，點(diǎn)種于含G418的平板上最后長(zhǎng)出的菌落數(shù)。具體過程如下：將重組子DL28的單菌落，分別接種于3 mL有選擇性培養(yǎng)基（含200 μg/mL G418的YEPD培養(yǎng)基）和無選擇性培養(yǎng)基（不含G418的YEPD培養(yǎng)基），30 ℃、230 r/min培養(yǎng)12 h，12 h后轉(zhuǎn)接，如是10 次。將每次傳代的有選擇性培養(yǎng)物和無選擇性培養(yǎng)物，劃線培養(yǎng)于對(duì)應(yīng)的有選擇性和無選擇性的YEPD平板，從每個(gè)平板上挑取100 個(gè)單菌落，分別接種于有選擇性和無選擇性的YEPD平板，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落數(shù)，計(jì)算重組質(zhì)粒p28的遺傳穩(wěn)定性。

1.8.2重組子質(zhì)?？剐詸z測(cè)

將重組子DL28接種于3 mL YEPD培養(yǎng)基（含200 μg/mL G418）中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h，并對(duì)菌液進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)為10-3、10-4、10-5。然后點(diǎn)種于分別含0、100、200、400、600、800 μg/mL G418的YEPD平板，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落數(shù)，確定重組子的抗生素抗性。以供試菌株（S. cerevisiae 28）作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1S. cerevisiae 28 GAD基因編碼區(qū)序列的PCR擴(kuò)增及分析

根據(jù)GenBank中釀酒酵母GAD基因序列為參考設(shè)計(jì)引物P1和P2，通過PCR順利擴(kuò)增出菌株28的GAD1基因的編碼區(qū)序列，測(cè)序結(jié)果表明，菌株28的GAD1基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1 758 bp（圖1），與釀酒酵母S288c的谷氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列的一致性達(dá)到98.58%。

圖1　1 GAD1GAD1基因序列Fig.1　GAD1 gene sequence

2.2目的基因的PCR擴(kuò)增

據(jù)釀酒酵母S288c的基因核苷酸序列設(shè)計(jì)引物P1和P2對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序得知，目的基因片段長(zhǎng)度為3 490 bp（圖2），包括目的基因全部序列長(zhǎng)度、兩個(gè)酶切位點(diǎn)（PvuⅡ和BglⅡ）以及保護(hù)堿基。該序列在國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與S. cerevisiae的菌株S288c基因序列一致性達(dá)到99%。

圖2　目的基因的PCR擴(kuò)增序列Fig.2　Target gene sequence

2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將目的基因片段與質(zhì)粒p UG6經(jīng)雙酶切后用T4 DNA連接酶連接構(gòu)建的重組質(zhì)粒p28的策略見圖3，重組質(zhì)粒p28堿基序列的理論長(zhǎng)度為7 480 bp。

圖3　重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.3　Construction of recombinant plasmid

利用酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒p28，并以重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的基因，并純化重組質(zhì)粒，然后進(jìn)行單酶切（PvuⅡ）和雙酶切（BglⅡ和EcoRⅤ）產(chǎn)物在8 g/L的瓊脂糖凝膠中用Tris-乙酸緩沖溶液進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖4。

圖4　重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定Fig.4　Identification of recombinant plasmid by endonuclease reaction and PCR

由圖4可知，泳道1重組質(zhì)粒單酶切結(jié)果表明，該質(zhì)粒大小與預(yù)期大小一致，重組質(zhì)粒雙酶切（泳道2）得到片段大小也與預(yù)期的分析一致由此可以確定，所得到的重組質(zhì)粒中已經(jīng)含有所需的外源基因，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.4谷氨酸脫羧酶活力的測(cè)定

2.4.1GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過Berthelot比色法獲得的GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式為Y = 0.014 4X+0.137 4（R2=0.999 1）。因此，待測(cè)液中GABA濃度在12.5～100.0 mmol/L的范圍內(nèi)與吸光度的相關(guān)性較好。

2.4.2重組子DL28的酶活力

本研究通過聚合酶鏈反應(yīng)和核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，從生物合成GABA的釀酒酵母28基因組DNA為模板，通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包括GAD1基因上游啟動(dòng)子及調(diào)控序列，下游終止子在內(nèi)的全長(zhǎng)基因序列，將全長(zhǎng)基因序列克隆至高拷貝質(zhì)粒pUG6，構(gòu)建重組質(zhì)粒p28，并以菌株28作為出發(fā)菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)G418抗性篩選得到重組子DL28，成功地構(gòu)建了該基因的真核表達(dá) 載體及基因工程菌。通過測(cè)定轉(zhuǎn)化液中GABA含量確定GAD酶活力，測(cè)定結(jié)果見圖5。據(jù)報(bào)道，提高GABA產(chǎn)量方法主要有溫度、pH值、底物濃度等發(fā)酵條件的優(yōu)化［21，24］；正突變體的選育［25］、真核表達(dá)或原核表達(dá)等基因改造［26-27］等。由圖5可知，重組子DL28的GAD酶活力比供試菌株28提高73.8%，因此，通過分子生物學(xué)法高效表達(dá)GAD活力是可行的，具有應(yīng)用價(jià)值。酵母菌是單細(xì)胞真核生物，在我國已有兩千多年的使用歷史，也是我國重要的微生物資源。因此，篩選產(chǎn)GABA的酵母菌菌株具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，并且通過篩選優(yōu)良、高產(chǎn)、安全的酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA，具有成本低、產(chǎn)率高、且安全等優(yōu)點(diǎn)。

圖5　轉(zhuǎn)化液中GAD的活力Fig.5　GAD activity in transformation liquid

2.5重組子質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性

2.5.1重組子質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)

將重組子DL28接種于選擇性培養(yǎng)基（YEPD培養(yǎng)基+200 ?g/mL G418）和無選擇性培養(yǎng)基（YEPD培養(yǎng)基），每隔12 h傳代一次，進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)10 次，檢測(cè)重組質(zhì)粒p28的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖6和圖7。重組質(zhì)粒p28分別在選擇性培養(yǎng)基和無選擇性培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)10 次，菌落數(shù)比值均為100%，說明重組質(zhì)粒p28的遺傳穩(wěn)定性良好。

圖6　重組子質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)Fig.6　Stability of recombinant plasmids

圖7　重組子質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)菌落形態(tài)圖Fig.7　Morphology of clones from recombinant plasmids

2.5.2重組子質(zhì)?？剐詸z測(cè)

圖8　重組子質(zhì)粒的抗性Fig.8　Resistance of recombinant plasmids to G418 at various concentrations

將重組子DL28點(diǎn)種于分別含0、100、200、400、600、800 μg/mL G418的YEPD平板，確定重組子的抗生素抗性結(jié)果見圖8。重組子在含800 μg/mL G418的YEPD平板上也能生長(zhǎng)，而對(duì)照組（供試菌株28）只能在不含G418的YEPD平板上才能生長(zhǎng)，因此重組子顯示了很好的抗生素抗性。

3　結(jié) 論

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平的提高，患高血壓、肥胖、糖尿病等慢性疾病的人數(shù)顯著增多。尤其，隨著人們生活節(jié)奏的加快，由于精神長(zhǎng)期處于緊張狀態(tài)和用腦過度使得越來越多的人患失眠、焦慮和記憶力下降等精神病，因此人們?cè)絹碓街匾暿澄锏臓I養(yǎng)和保健功能。據(jù)研究報(bào)道，γ-氨基丁酸是一種抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)［2］，具有諸多保健功能，因此，本研究以釀酒酵母28基因組DNA為模板，擴(kuò)增到該菌株的谷氨酸脫羧酶基因的編碼區(qū)序列（GAD1），其長(zhǎng)度為1 758 bp，經(jīng)比對(duì)與釀酒酵母S. cerevisiae S288c的同源性達(dá)到98.58%；在此基礎(chǔ)上又?jǐn)U增出包括GAD基因上游啟動(dòng)子及調(diào)控序列、下游終止子在內(nèi)的全長(zhǎng)基因序列，長(zhǎng)度為3 490 bp，該序列與S. cerevisiae S288c基因序列一致性達(dá)到99%。將全長(zhǎng)基因序列克隆至高拷貝質(zhì)粒pUG6，構(gòu)建重組質(zhì)粒p28。以菌株28作為出發(fā)菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)G418抗性篩選得到轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步經(jīng)過PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，質(zhì)粒提取及酶切驗(yàn)證，確證得到重組子DL28。經(jīng)重組質(zhì)粒p28的特性研究得知，重組子DL28具有良好的遺傳穩(wěn)定性，無抗性傳代培養(yǎng)10 次重組質(zhì)粒不丟失。轉(zhuǎn)化后進(jìn)行酶活力測(cè)定，重組子DL28的GAD酶活力比菌株28提高了73.8%，這為提高重組子DL28的生物保健品產(chǎn)能具有較高的參考價(jià)值。

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Molecular Cloning and Expression of Glutamic Acid Decarboxylase Gene from Saccharomyces cerevisiae for Biosynthesis of γ-Aminobutyric Acid

Wuyundalai1，2， ZHANG Borun2， GUO Xuena2， WANG Zhaoyue2，*
（1. College of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China；2. Institute of Microbiology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China）

Glutamic acid decarboxylase （GAD） is a rate-limiting enzyme for the biocatalysis of γ-aminobutyric acid（GABA）. Therefore， GAD gene is the key gene to regulate the production of GABA. In order to improve the productive capacity of GABA in yeasts， in the present study， we used the CTAB method to purify S. cerevisiae 28 genomic DNA as the template. A 1 758 bp gene fragment was amplified and sequenced as the GAD1 gene that had 98.58% homology with the S. cerevisiae S288c gene. The primers were designed for amplifyi ng the 3 490 bp sequence of GAD1 full-length ge ne，including GAD1 gene upstream promoter， regulatory sequence and downstream terminator. The full-length gene sequence was cloned into plasmid pUG6， to construct the recombinant plasmid p28. The strain 28 was used as the starting strain for the conversion， and the transformant was gained by G418 resistance screening， and further verified by PCR， plasmid extracti on and double digest identification as the recombinant DL28. By exploring the characteristics of the recombinant plasmid p28， we found that it had good genetic stability， and the recombinant plasmid was still stable after subculture for 10 generations without resistance training. The enzyme activity was determined after transformation， and the GAD activity of recombinant DL28 was improved by 73.8% when compared with the strain 28. Therefore， GAD gene is highly expressed in recombinant DL28， which also has higher G418 resistance.

S. cerevisiae； γ-aminobutyric acid； glutamic acid decarboxylase； cloning； expression

Q939.97

A

1002-6630（2015）13-0131-06

10.7506/spkx1002-6630-201513025

2014-08-27

內(nèi)蒙古自治區(qū)應(yīng)用技術(shù)研發(fā)資金計(jì)劃項(xiàng)目（20130438）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014MS0358）

烏云達(dá)來（1975—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：wydl@imau.edu.cn

王肇悅（1967—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)楣I(yè)酵母代謝工程及調(diào)控。E-mail：wangzhaoyue@126.com