曹春廷，孫叢龍，白衛(wèi)濱，*，孫建霞，李國(guó)強(qiáng)，歐仕益，楊　勇*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；3.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工 學(xué)院，廣東 廣州 510006）

柘樹(shù)果實(shí)的抗乳腺癌活性部分的提取、分離及結(jié)構(gòu)鑒定

曹春廷1，2，孫叢龍2，白衛(wèi)濱2，*，孫建霞3，李國(guó)強(qiáng)2，歐仕益2，楊勇1，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；3.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工 學(xué)院，廣東 廣州 510006）

為了得到柘樹(shù)果實(shí)中具有抗乳腺癌活性的化合物，以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為細(xì)胞模型，通過(guò)噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法評(píng)價(jià)柘樹(shù)果實(shí)石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、以及正丁醇浸膏粗提取物部位的功能，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位具有明顯的抑制乳腺癌細(xì)胞的活性，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-M B-231和MCF-7的IC50分別為：75.4 μg/mL和66.8 μg/mL。采用Sephad ex LH-20柱層析和硅膠柱層析對(duì)乙酸乙酯部位進(jìn)行分離，采用單晶X衍射對(duì)得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到2 種晶體主成分，分別為4'-O-甲基-吡喃異黃酮、吡喃異黃酮。采用MTT方法對(duì)獲得的2 種單體進(jìn)行抗乳腺癌活性研究，發(fā)現(xiàn)吡喃異黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到56.7%。結(jié)果表明，柘樹(shù)果實(shí)乙酸乙酯部位含有抗乳腺癌成分，且分離得到2 種類(lèi)異黃酮化合物，其中吡喃異黃酮體現(xiàn)出一定的抗乳腺癌活性。

柘樹(shù)果實(shí)；分離提取；抗乳腺癌；結(jié)構(gòu)鑒定

柘樹(shù)（Cudrania tricuspidata）為?？疲∕oraceae）柘屬（Cudrania）植物，又名柘木、柘桑、刺桑、奴柘等，全世界存在約有6 種柘屬植物，主要分布在亞洲和大洋洲。在我國(guó)，柘屬植物資源非常豐富，存在5 個(gè)品種和2 個(gè)變種［1］，主要分布在我國(guó)華南、西南、華北（除內(nèi)蒙古外）各 省。柘樹(shù)具有很大的藥用價(jià)值，前人已經(jīng)從柘 樹(shù)中分離純化出多種化合物，如黃酮、異黃酮、氧雜蒽酮、生物堿、糖類(lèi)等［1-4］，對(duì)其活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤［5］、抗氧化［6］、保護(hù)肝臟［7］、抗炎鎮(zhèn)痛［8-9］、保護(hù)肝臟［10］和抗結(jié)核［11］等作用，而這些生物活性主要是柘樹(shù)中黃酮類(lèi)化合物的作用［12-14］。Choi等［15］研究證明了柘樹(shù)中含有抗乳腺癌的化學(xué)成分，從柘樹(shù)根部分離得到的吉利柘樹(shù)素A對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖有抑制作用，IC50為20.0 μg/mL。但上述研究主要集中在柘樹(shù)的干燥根、根皮樹(shù)皮以及柘木，而對(duì)柘樹(shù)果實(shí)的研究相對(duì)較少。研究表明，柘果也具有很多活性物質(zhì)［16-19］，如山柰、蘆丁、槲皮素等，但由于柘樹(shù)樹(shù)齡超過(guò)50 年屬于國(guó)家一級(jí)保護(hù)樹(shù)種，禁止砍伐，而柘果由于一年一結(jié)果，并且同柘樹(shù)根、柘樹(shù)莖皮以及柘樹(shù)莖研究利用相比，對(duì)其功效成分分析及營(yíng)養(yǎng)作用知之甚少，對(duì)其開(kāi)發(fā)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，因此急需開(kāi)展對(duì)柘果的研究。

截止目前，尚未發(fā)現(xiàn)柘樹(shù)果實(shí)中抗乳腺癌的化學(xué)成分研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)柘樹(shù)果實(shí)的抗乳腺癌化學(xué)成分開(kāi)展研究，以期為其在抗乳腺癌方面的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用原料柘樹(shù)新鮮果實(shí)，采于山東省煙臺(tái)市。

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞 暨南大學(xué)醫(yī)藥中心；MCF-7細(xì)胞CCTCC、MDA-MB-231細(xì)胞CCTCC、1640培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素 美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國(guó)Amresco公司；水溶性VE（Trolox） 美國(guó)Sigma公司；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

柱層析用硅膠（100～200、200～300 目）、GF254硅膠薄層預(yù)制板 青島海洋化工廠；Sephadex LH-20丙基葡聚糖凝膠 GE Healthcare（中國(guó)）有限公司；薄層制備板（10 cm×10 cm） 煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司；酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo Fisher Scientifi c公司；超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備公司；二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Forma有限責(zé)任公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；三用紫外分析儀 上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1柘樹(shù)果實(shí)粗提物獲得

稱取新鮮柘樹(shù)果實(shí)270 g，勻漿機(jī)打碎后，置于提取罐中，快速加入1 000 mL甲醇溶劑，常溫下靜置浸提，24 h后收集浸提液，按上述操作，重復(fù)多次，合并浸提液。將獲得的全部浸提液，1 500 r/min離心4 h，去掉浸提液中的懸浮物，取上清，在60 ℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得浸膏（約200 g）。將得到的總浸膏用適量水混懸于燒杯中，依次在浸提罐中用純石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液，在80 ℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得石油醚（petroleum ether，PE）浸膏31 g，乙酸乙酯（ethyl acetate，AE）浸膏120 g，以及正丁醇（n-butyl alcohol，n-BuOH）浸膏26 g。

1.3.2柘樹(shù)果實(shí)抗乳腺癌有效部位確定

稱取相同量獲得的PE、AE，以及n-BuOH溶于二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）配制為母液，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)［20］，評(píng)價(jià)三者的抑癌活性。其具體實(shí)驗(yàn)步驟為：收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，然后在96 孔板上鋪板，每孔加入100 μL，使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度4 000/孔，且96 孔板的邊緣孔用無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液填充；含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2，37 ℃孵育，至細(xì)胞開(kāi)始在孔底貼壁生長(zhǎng)（96 孔平底板），加入質(zhì)量濃 度梯度（0、10、20、40、80 μg/mL）的粗提物，原則上細(xì)胞貼壁后即可加藥；用移液槍吸掉培養(yǎng)基，再加入含藥培養(yǎng)基。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組（加入培養(yǎng)基、MTT、DMSO）和對(duì)照組（加入細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、DMSO，不加藥物）。含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2，37 ℃孵育24 h；每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔內(nèi)混合溶液，終止培養(yǎng)；然后，每孔加入100 μL DMSO溶液，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上振搖5 min，使生成的甲瓚充分溶解，然后在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量每個(gè)孔的光密度（OD）值。按下式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

式中：OD0為空白組的光密度值；OD1為對(duì)照組的光密度值；OD為實(shí)驗(yàn)組的光密度值。

1.3.3柘樹(shù)果實(shí)有效成分分離、結(jié)構(gòu)鑒定

活性部位經(jīng)硅膠柱層析。稱量200～300 目硅膠，30 倍于上樣量，采用干法上樣法，選用石油醚-乙酸乙酯容積系統(tǒng)，按照比例（100∶3～0∶100）進(jìn)行梯度洗脫，每50 mL收集一個(gè)餾分。在濃硫酸香草醛作為顯色劑條件下，用薄層層析分析合并餾分，再用Sephadex LH-20柱色譜進(jìn)行分離純化，用的凝膠柱為25 mm×1 200 mm大小，流動(dòng)相為氯仿和甲醇，其體積比為1∶1，其余步驟與硅膠柱層析方法一致。分離得到晶體化合物采用單晶衍射進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.4類(lèi)異黃酮物質(zhì)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

兩種類(lèi)異黃酮化合物用DMSO溶解，母液濃度為50 mmol/L。MTT實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果處理同1.3.2節(jié)。

2　結(jié)果與分析

2.1柘樹(shù)果實(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231抑制效果

圖1　3 種粗提物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較Fig.1　Inhibitory rates of three fractions against the growth of MDA-MB-231 cells

如圖1所示，與PE和n-BuOH部位相比較，AE部位抑制效果更明顯，IC50為75.4 μg/mL，與空白組比較，有顯著性差異（P＜0.05），表明柘樹(shù)果實(shí)AE部分是含有抗乳腺癌成分主要活性部位。

2.2柘樹(shù)果實(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制效果

圖2　3 種粗提物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率比較Fig.2　Inhibitory rates of three fractions against the growth of MCF-7 cells

如圖2所示，與PE和n-BuOH部位相比較，AE部位表現(xiàn)出了明顯的抑癌活性，IC50為66.8 μg/mL，與空白組比較，有顯著性差異（P＜0.05），表明柘樹(shù)果實(shí)AE部分是含有抗乳腺癌成分主要活性部位。與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231相比，柘樹(shù)果實(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7作用更強(qiáng)。

2.3柘樹(shù)果實(shí)分離純化化合物晶體結(jié)構(gòu)

硅膠柱層析結(jié)束，選擇濃硫酸香草醛作為顯色劑，經(jīng)薄層層析分析合并，得到多個(gè)總餾分。再將總餾分經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20柱層析純化，運(yùn)用單晶衍射的方法，對(duì)得到量大的2 個(gè)晶體化合物：4'-O-甲基-吡喃異黃酮（45 mg）、吡喃異黃酮（35 mg）并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

化合物4'-O-甲基-吡喃異黃酮：淡黃色針晶，化合物吡喃異黃酮：黃色方晶。2 個(gè)晶體的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖3　4 3 4'-O-甲基-吡喃異黃酮（a）和吡喃異黃酮（b）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3　Chemical structures of 4'-O-methylalpinumfisoflavone （a） and alpinumisoflavone （b）

表 1 4'-O-甲基-吡喃異黃酮和吡喃異黃酮晶體數(shù)據(jù)Table1　Crystal structural data of 4 -methylalpinumfisoflavone and alpinumisoflavone

2.4類(lèi)異黃酮物質(zhì)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

圖1、2表明，柘樹(shù)果實(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制作用更明顯，因此選擇MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究獲得的兩種類(lèi)異黃酮晶體4'-O-甲基-吡喃異黃酮和吡喃異黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)起抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)所用的類(lèi)異黃酮物質(zhì)的劑量為0、10、20、40、80 μmol/L，結(jié)果如表2。在80 μmol/L濃度作用下，4'-O-甲基-吡喃異黃酮和吡喃異黃酮兩種類(lèi)異黃酮物質(zhì)對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為12.9%和56.7%，吡喃異黃酮表現(xiàn)出一定的抗乳腺癌活性。

表 2 4'-O-甲基-吡喃異黃酮對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率Table2　Inhibitory rates of 4' -methylalpinumisoflavone against the growth of MCF-7 cells

3　討 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)柘果在乳腺癌方面作用進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)柘樹(shù)果實(shí)具有抗乳腺癌作用，對(duì)不同株系的乳腺癌細(xì)胞作用效果不同，其MDA-MB-231和MCF-7的IC50分別為：75.4 μg/mL和66.8 μg/mL，且乙酸乙酯部位是最有效部位。并進(jìn)一步分離純化得到2 種類(lèi) 異黃酮類(lèi)晶體化合物吡喃異黃酮和4'-O-甲基-吡喃異黃酮。研究吡喃異黃酮和4'-O-甲基-吡喃異黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用，發(fā)現(xiàn)吡喃異黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有一定的抗乳腺癌活性。有研究發(fā)現(xiàn)吡喃異黃酮和4'-O-甲基- 吡喃異黃酮具有氧化酶抑制活性，Han Xianghua等［16］研究發(fā)現(xiàn)柘果中的4'-O-甲基-吡喃異黃酮、吡喃異黃酮對(duì)鼠大腦單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）抑制作用，對(duì)MAO的IC50值分別為23.9 μmol/L和25.8 μmol/L。證明本實(shí)驗(yàn)分離出的兩種類(lèi)異黃酮物質(zhì)具有一定的生物活性。

異黃酮類(lèi)物質(zhì)具有預(yù)防乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病和骨質(zhì)疏松等疾?。?1］，有很強(qiáng)的生物效應(yīng)。已有的很多科學(xué)研究表明異黃酮類(lèi)化合物具有抗腫瘤的作用［22-24］。目前學(xué)術(shù)界公認(rèn)的異黃酮抗腫瘤作用機(jī)制有：1）通過(guò)直接清除自由基或提高抗氧化物酶的活性來(lái)清除自由基，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；2）通過(guò)影響致癌物質(zhì)的代謝酶的活性等來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生；3）異黃酮類(lèi)化合物能夠顯著地提高腫瘤細(xì)胞對(duì)某些化療藥物的敏感性［25］。

吡喃異黃酮和4'-O-甲基-吡喃異黃酮比傳統(tǒng)異黃酮母核結(jié)構(gòu)多一個(gè)聯(lián)環(huán)，并且二者結(jié)構(gòu)上只存在一個(gè)取代基的差異，但在抗乳腺癌活性研究中表現(xiàn)出不同的抑制效果，證明結(jié)構(gòu)對(duì)功能的影響。下一步擬研究吡喃異黃酮和4'-O-甲基-吡喃異黃酮結(jié)構(gòu)、生物活性及其作用機(jī)制，進(jìn)一步為柘樹(shù)果實(shí)營(yíng)養(yǎng)功能的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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Extraction， Separation and Structure Identification of Anti-breast Cancer Compounds from Cudrania tricuspidata Fruits

CAO Chunting1，2， SUN Conglong2， BAI Weibin2，*， SUN Jianxia3， LI Guoqiang2， OU Shiyi2， YANG Yong1，*
（1. College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China；2. Department of Food Science and Engineering， Jinan University， Guangzhou 510632， China；3. Faculty of Chemical Engineering and Light Ind ustry， Guangdong University of Technology， Guangzhou 510006， China）

The purpose of the present work was to obtain anti-breast cancer compounds from Cudrania tricuspidata fruits. The methanol extract of Cudrania tricuspidata fruits was sequentially extracted with petroleum ether （PE）， ethyl acetate （AE） and n-butyl alcohol （n-BuOH） to obtain PE， AE and n-BuOH fractions. MTT assay was used to evaluate the anti-breast cancer activity of the methanol extract and its three fractions against breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7. The results showed that the AE fraction had significant inhibitory activity on MDA-MB-231 and MCF-7 cells with half maximal inhibitory concentrations （IC50） of 75.4 and 66.8 μg/mL， respectively. Then， the AE fraction was further separated by silica gel column chromatography a nd Sephadex LH-20 column chromatography assay. The structures of crystals obtained from this separation process were identifi ed using single-crystal X diffraction. Two major crystal components were identifi ed including 4'-O-methylalpinumisofl avone and alpinumisofl avone. As evaluated by MTT assay， the inhibitory rate of alpinumisofl avone against MCF-7 cell growth was 56.7%. Therefore， t he AE fraction from Cudrania tricuspidata fru its containing isofl avones and alpinumisofl avones has pot ent anti-breast cancer activity depending on the presence of alpinumisofl avone.

Cudrania tricuspidata （Carr.） Bur. fruits； separation and extraction； anti-breast cancer； structural identifi cation

R151

A

1002-6630（2015）13-048-04

10.7506/spkx1002-6630-201513010

2014-12-27

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD36B04）

曹春廷（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)。E-mail：caochunting1@163.com

白衛(wèi)濱（1978—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與毒理安全性評(píng)價(jià)。E-mail：baiweibin@163.com楊勇（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與技術(shù)。E-mail：yangyong676@163.com