陳軒，廖秀云，陶旻，羅寶正，薄清如，沙才華，黃海超，徐海聶，楊素

（珠海出入境檢驗檢疫局國家外來病檢測重點實驗室，廣東珠海519015）

Taqman探針熒光PCR檢測鯊魚源性成分

陳軒，廖秀云，陶旻，羅寶正*，薄清如，沙才華，黃海超，徐海聶，楊素

（珠海出入境檢驗檢疫局國家外來病檢測重點實驗室，廣東珠海519015）

針對鯊魚產(chǎn)品摻雜造假增多而缺乏有效鑒定技術的情況，作者根據(jù)GenBank中鯊魚基因的線粒體DNA（mtDNA）序列，使用分子生物學軟件Primer Express 2.0設計了一套特異性引物和探針，用來建立Taqman探針熒光PCR檢測鯊魚源性成分的方法。結果表明，對13份已鑒定為鯊魚魚翅的樣品進行檢測，全部出現(xiàn)特異性擴增曲線，陰性對照沒有熒光增長。方法特異性強，對市場購買的12份鯊魚源性樣品及9份其他魚類樣品進行檢測，12份鯊魚樣品均出現(xiàn)熒光擴增曲線，而非鯊魚樣品均未出現(xiàn)熒光增長；方法靈敏度較高，可檢測到的最低質(zhì)粒拷貝數(shù)量級為10拷貝/μL；方法快速準確，操作簡便，重復性好，穩(wěn)定可靠，可應用于市場上魚翅等常見鯊魚源性產(chǎn)品的真假鑒定。

鯊魚源性成分；Taqman探針；熒光PCR；檢測

鯊魚隸屬于軟骨魚綱、板鰓亞綱、鯊總目，大約包括8目35科465多種［1］，是位于海洋食物鏈頂層的重要魚類。以鯊魚為原料的加工產(chǎn)品包括魚翅、鯊魚硫酸軟骨素、鯊魚肝油、鯊魚肉等，均具備一定的藥用、保健或營養(yǎng)價值［2，5］。近年來，由于鯊魚產(chǎn)品消費趨熱，鯊魚的捕殺量常年在較高水平（73～80× 104t/year，數(shù)據(jù)來源：FAO Yearbook.Fishery and Aquaculture Statistics.2012）。在巨額經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，鯊魚產(chǎn)品摻雜造假的情況時有發(fā)生，尤其是魚翅類產(chǎn)品造假更是屢見不鮮。目前對鯊魚產(chǎn)品的研究主要集中在鯊魚產(chǎn)品功能成分的提純和生物活性研究［2-4］、鯊魚產(chǎn)品對疾病的治療和保健機理［5-10］、鯊魚種屬鑒定［11-12］等方面，而對鯊魚產(chǎn)品市場所急需的鯊魚總類成分檢測與鑒定技術（非鑒定到種）的研究還較為少見，僅見郭云霞等報道了針對鯊魚源性成分建立了PCR鑒別方法和SYBR Green實時熒光PCR方法［13-14］。為維護正常市場秩序和消費者合法權益，迫切需要開發(fā)出特異性強、靈敏度高、快速準確的鯊魚源性成分檢測鑒定方法。作者利用熒光PCR特異性強、快速靈敏、簡便而不易污染等特點建立了基于Taqman探針的熒光PCR檢測鯊魚源性成分的方法。

1　材料與方法

1.1樣品

13份魚翅樣品為本實驗室留存樣品，另外12份鯊魚源性樣品（包括4份新鮮鯊魚和8份魚翅樣品）及9份其他魚類樣品（包括美洲鰻2份、日本鰻2份、龍頭魚1份、羅非魚1份、池魚1份、馬鮫魚1份、鳙魚1份）均購自珠海海鮮及干貨市場。

1.2主要試劑

DNA提取試劑盒：E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit，美國OMEGA公司產(chǎn)品；TIANGEN Taq PCR Mastermix：天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD 18-T、DNA Marker DL 2000：購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3主要儀器

Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System：美國ABI公司產(chǎn)品；Alpha Imager HP凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Alpha Innotech公司產(chǎn)品；Sigma 3-18 K小型高速冰凍臺式離心機：德國Sartorius公司產(chǎn)品；NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer紫外分光光度計：美國NanoDrop Technologies公司產(chǎn)品。

1.4普通PCR引物及熒光PCR引物、探針的設計和合成

根據(jù)GenBank中公布的鯊魚線粒體DNA（mtDNA）序列，利用生物學軟件Clustal X比對后在高度保守區(qū)域用Primer Express 2.0分別設計了一對普通PCR引物和一套熒光PCR引物、探針，由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物、探針序列見表1。

表1　引物和探針序列Table 1Sequences of primers and probe

1.5魚翅樣品的普通PCR擴增及種屬鑒定

按照DNA提取試劑盒說明書提取樣品DNA。以13份魚翅樣品DNA為模板進行普通PCR，并對PCR產(chǎn)物進行克隆測序。PCR反應體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，100 μmol/L上下游引物各1.0 μL，DNA模版2.0 μL，補水至25 μL。反應程序：94℃2 min；94℃30 s，50℃1 min，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃7 min。擴增結束后于質(zhì)量濃度2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將PCR產(chǎn)物測序比對，確定其種屬來源。

1.6熒光PCR檢測鯊魚源性成分方法的建立

以13份魚翅樣品DNA為模板進行熒光PCR擴增。反應體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，20 μmol/L上下游引物各1.0 μL，10 μmol/ L Taqman探針1.0 μL，DNA模版5.0 μL，補水至25 μL。反應程序：94℃2 min；94℃10 s，60℃40 s（收集熒光信號），40個循環(huán)。

1.7熒光PCR方法特異性試驗

以市場購買的12份鯊魚源性樣品和9份其他魚類樣品中提取的DNA為模板，使用上述反應體系和條件進行熒光PCR擴增，驗證所建立的熒光PCR方法的特異性。

1.8熒光PCR方法靈敏度試驗

將熒光PCR產(chǎn)物電泳檢測后的目的條帶割膠回收，進行克隆、測序鑒定，并以此重組質(zhì)粒作為陽性標準品。將重組質(zhì)粒用紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算成目的基因的拷貝數(shù)。提取陽性克隆質(zhì)粒，測定濃度后，以10倍梯度稀釋到10-10，對梯度稀釋的樣本進行熒光PCR檢測。

1.9穩(wěn)定性試驗

以鯊魚陽性對照為模板，使用本試驗建立的方法在兩個時間段各做20次重復，通過計算Ct值的變異系數(shù)驗證批內(nèi)及批間穩(wěn)定性。

2　結果與分析

2.1魚翅樣品的普通PCR擴增及種屬鑒定結果

13份魚翅樣品均被成功進行PCR擴增，產(chǎn)物大小約為310 bp，與預期符合（見圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序，在GenBank中比對，確認此13份魚翅樣品均為鯊魚源性，分別來自大青鯊（4份）、犁鰭檸檬鯊（2份）、黑吻真鯊、太平洋鼠鯊、錘頭雙髻鯊、淺海長尾鯊、澳洲斜鋸牙鯊、白邊真鯊和鐮狀真鯊。

圖1　13份魚翅樣品PCR結果Fig.1PCR Results for 13 samples of shark’s fin

2.2熒光PCR檢測鯊魚源性成分方法的建立

對已確認為鯊魚翅的13份樣品均成功進行了擴增，出現(xiàn)了典型的S型擴增曲線，陰性對照未見熒光增長（見圖2）。反應時間較普通PCR大大縮短。

圖2　13份魚翅樣品的熒光PCR結果Fig.2Fluorescent PCR results for 13 samples of shark’s fin

2.3熒光PCR方法特異性試驗

所建立的方法對市場購買的12份鯊魚源性樣品（4份新鮮鯊魚和8份魚翅樣品）可以進行特異性擴增，而屬于其他種屬魚類的9份樣品均未見熒光增長（見圖3）。

2.4熒光PCR方法靈敏度試驗

將8個濃度梯度的陽性對照進行熒光PCR反應，可檢測到的最低質(zhì)?？截悢?shù)為10拷貝/μL的數(shù)量級（見圖4），即為該檢測方法的靈敏度。

2.5穩(wěn)定性試驗

對兩次試驗所獲得的Ct值用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0分析，批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.10%和1.22%，批間變異系數(shù)為1.32%，說明20次批內(nèi)重復和2次批間重復試驗結果符合性較好，方法穩(wěn)定（圖5）。

3　結語

圖3　熒光PCR方法特異性試驗Fig.3Specificity test for the method of fluorescent PCR

圖4　熒光PCR方法靈敏度試驗Fig.4Sensibility test for the method of fluorescent PCR

在現(xiàn)有檢測鯊魚源性成分的方法中，PCR方法具有較高的特異性和靈敏性［13］，但需要電泳檢測，結果判讀不如實時熒光PCR方便快捷，并且開蓋檢測存在污染的風險。SYBR Green實時熒光PCR方法與普通PCR方法相比具有更高的靈敏度［14］，但是由于SYBR Green熒光染料不僅能與靶基因的擴增產(chǎn)物結合，也可以與非特異性PCR產(chǎn)物結合，理論上存在假陽性的可能。TaqMan探針熒光PCR方法除了需一對特異性引物，還增加了一條與模版互補的特異性探針，探針上5'端和3'端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團，每進行一個特異性擴增循環(huán)釋放一個分子的熒光染料，非特異性產(chǎn)物對檢測信號沒有影響。因此，與SYBR Green熒光PCR方法相比，Taqman探針熒光PCR方法具有更高的特異性［15］，但其對探針的設計要求較高，需要由試驗驗證。作者根據(jù)GenBank中公布的鯊魚線粒體DNA（mtDNA）序列，在其高度保守區(qū)域設計了一對特異性引物和探針，實驗結果表明該引物和探針的特異性較好，對鯊魚樣品均能進行特異性擴增，并且靈敏度較高，能檢測到的最低質(zhì)?？截悢?shù)量級為10拷貝/μL。

圖5　熒光RT-PCR重復性和穩(wěn)定性試驗Fig.5Repeatability and stability test for the method of fluorescent PCR

本方法可應用于市場上常見的鯊魚產(chǎn)品的真假鑒定，如干魚翅、泡發(fā)魚翅、鯊魚肉、鯊魚硫酸軟骨素初級加工品等。但對于部分深加工產(chǎn)品，如鯊魚肝油等，由于經(jīng)過較為復雜的加工過程，其DNA有可能被破壞或降解，應用可能受到一定的限制。

［1］Compagno，L.J.V.FAO species catalogue.Vol.4.Sharks of the world.Annotated and illustrated catalogue of shark species known to date.Part 2.Carcharhiniformes.FAO Fisheries Synopsis.（125）4，Pt.1984，2：251-655.

［2］徐鳳香，高昕，李昭勇，等.魚翅營養(yǎng)成分提取與定性分析［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（1）：225-227.

XU Fengxiang，GAO Xin，LI Zhaoyong，et al.Extraction and analysis of nutrient components of shark fin［J］.Science and Technology of Food Industry，2007，28（1）：225-227.（in Chinese）

［3］楊偉興.鯊魚軟骨中血管生成抑制因子的活性檢測［J］.中山大學研究生學刊：自然科學版，2001，22（1）：18-21.

YANG Weixing.Using chicken chorioallantoic membrane to test the activity of angiogenesis inhibitor derived from shark cartilage［J］.Journal of the Graduates Sun YAT-SEN University：Natural Sciences，2001，22（1）：18-21.（in Chinese）

［4］沈先榮，吉冬梅，賈福星，等.鯊魚軟管血管生成抑制因子的純化和功能［J］.生物化學與生物物理學報，2000，32（1）：43-48.

SHEN Xianrong，JI Dongmei，JIA Fuxing，et al.Purification and functional characterization of a shark cartilage factor inhibitory to angiogenesis［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2000，32（1）：43-48.（in Chinese）

［5］陸焰，劉冰冰，楊文鴿.鯊魚肉酶解物的抗氧化作用及其穩(wěn)定性研究［J］.食品科技，2001，36（12）：135-139.

LU Yan，LIU Bingbing，YANG Wenge，et al.The anti-oxidant ability and its stability of hydrolysates obtained from shark meat［J］.Food Science and Technology，2011，36（12）：135-139.（in Chinese）

［6］Bradley M Wetherbee et al.Lipid composition of the liver oil of deep-sea sharks from the Chatham Rise New Zealand［J］. Comparative Biochemistry and Physiology，2000，125：511-521.

［7］Joon-Son Sim，et al.Evaluation of chondroitin sulfate in shark cartilage powder as a dietary supplement：Raw materials and finished products［J］.Food Chemistry，2007，101：532-539.

［8］蔣哲，孟凡國，陳瓊?cè)A，等.鯊魚皮膠原蛋白肽的成分分析及對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活力的影響［J］.廈門大學學報：自然科學版，2008，47（6）：879-882.

JIANG Zhe，MENG Fanguo，CHEN Qionghua，et al.The effects of shark skin peptides on ACE and the analysis of peptides［J］. Journal of Xiamen University：Natural Science，2008，47（6）：879-882.（in Chinese）

［9］謝果凰.鯊魚硫酸軟骨素的分離提純及其抗氧化功能的研究［D］.寧波：寧波大學，2010.

［10］范秋領，黃才國，金艷，等.鯊魚肝蛋白粗提物對大鼠肝線粒體抗氧化功能的影響［J］.華東理工大學學報：自然科學版，2005，31（5）：598-634.

FAN Qiuling，HUANG Caiguo，JIN Yan，et al.Effects of shark protein crude extract administration on liver mitochondrial antioxidant defenses in rats［J］.Journal of East China University of Science and Technology：Natural Science Edition，2005，31（5）：598-634.（in Chinese）

［11］Danillo P et al.Discrimination of shark species by simple PCR of 5S rDNA repeats［J］.Genetics and Molecular Biology，2008，311：361-365.

［12］Blanco M et al.Identification of shark species in seafood products by forensically information nucleotide sequencing［J］.Chemical Society，2008，56：9868-9874.

［13］郭云霞，包建強，張舒亞，等.食品中鯊魚源性成分真實性PCR鑒別研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（10）：421-424.

GUO Yunxia，BAO Jianqiang，ZHANG Shuya，et al.Study on authentication of shark derived material in food using PCR［J］. Science and Technology of Food Industry，2011，32（10）：421-424.（in Chinese）

［14］郭云霞，張舒亞，諶鴻超，等.SYBR Green實時熒光PCR檢測食品中鯊魚源性成分真實性方法的建立［J］.食品與生物技術學報，2012，31（12）：1300-1306.

GUO Yunxia，ZHANG Shuya，et al.Authentication of shark derived material in food using SYBR green fluorescence real-time PCR［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（12）：1300-1306.（in Chinese）

［15］張舒亞，諶鴻超，宋青，等.食品和飼料中火雞源性成分的實時熒光PCR檢測方法［J］.食品與生物技術學報，2013，32（2）：207-211.

ZHANG Shuya，CHEN Hongchao，SONG Qing，et al.Identification of turkey derived material in food and feed using real-time PCR［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（2）：207-211.（in Chinese）

Detection of Shark Derived Materials by Taqman Probe Fluorescent PCR

CHEN Xuan，LIAO Xiuyun，TAO Min，LUO Baozheng*，BO Qingru，SHA Caihua，HUANG Haichao，XU Hainie，YANG Su
（State Key Quarantine Laboratory of Exotic Animal Disease，Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai 519015，China）

As the problem of adulteration of shark products worsens and the effective detection method lacks，this study designed a set of primers and probe based on the mitochondria DNA sequences of shark published in GenBank using the software of Primer Express 2.0，so as to establish a method of Taqman probe fluorescent PCR for the detection of shark derived materials.Results showed that 13 samples that had been identified as shark fins all displayed the amplified curves.The specificity of this method was good with all of 12 shark derived samples indicating the existence of shark DNA and with no amplification curves for the other 9 samples not derived from shark species. The detection is sensitive and the minimum detectable plasmid copy number was 10 copies/μL.It isalso rapid and simple and the results have good repeatability and stability.Therefore，the method can be applied to the identification of shark derived products in marketplaces，such as fins.

shark derived material，Taqman probe，fluorescent PCR，detection

TS 254.7

A

1673—1689（2015）10—1083—06

2014-09-17

珠海出入境檢驗檢疫局資助項目（ZH2013-2）。

陳軒（1983—），男，廣東梅州人，理學碩士，高級獸醫(yī)師，主要從事動物檢驗檢疫與分子生物學檢測研究。E-mail：65561977@qq.com

羅寶正（1975—），男，山東萊西人，理學博士，研究員，主要從事動物傳染病分子診斷研究。E-mail：bzluo@163.com