劉艷芳，唐慶九，張勁松，Steve W.Cui，楊焱，吳迪，周帥，唐傳紅，張忠，顏夢秋

（1.國家食用菌工程技術研究中心/農(nóng)業(yè)部應用真菌資源與利用重點開放實驗室/上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，上海201403；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫214122；3.加拿大農(nóng)業(yè)部圭爾夫食品研究中心，加拿大N1G5C9）

“滬農(nóng)靈芝1號”品種子實體多糖分析

劉艷芳1，2，唐慶九*1，張勁松1，Steve W.Cui2，3，楊焱1，吳迪1，周帥1，唐傳紅1，張忠1，顏夢秋1

（1.國家食用菌工程技術研究中心/農(nóng)業(yè)部應用真菌資源與利用重點開放實驗室/上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，上海201403；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫214122；3.加拿大農(nóng)業(yè)部圭爾夫食品研究中心，加拿大N1G5C9）

以水提醇沉法獲得“滬農(nóng)靈芝1號”子實體中的靈芝多糖，并對其結構特征和含量進行分析。高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射儀-示差折光檢測儀聯(lián)用分析結果表明，該多糖重均相對分子質(zhì)量為2.28×106，均方根半徑為150.1 nm，多分散系數(shù)（Mw/Mn）為1.14，在水溶液中呈棒狀結構。單糖組成及甲基化分析結合酶解試驗結果表明，該多糖為β-1，3/1，6-葡聚糖。經(jīng)液相色譜法定量檢測，段木栽培所得靈芝子實體中，該多糖質(zhì)量分數(shù)為0.52 mg/g，顯著高于袋料栽培所得子實體中相應組分的含量。

靈芝多糖；多角度激光光散射；分子特征

靈芝是我國著名的藥用真菌，屬擔子菌門、非褶菌目、靈芝菌科、靈芝屬［1］?，F(xiàn)代研究表明，靈芝具有多種生物活性，臨床上主要用于治療慢性支氣管炎、神經(jīng)衰弱、冠心病、肝炎、高血脂、高血壓、白細胞減少癥等疾?。?］。中國藥典［3］規(guī)定赤芝（Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.）和紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子實體為藥用正品?！皽r(nóng)靈芝1號”為近年來廣泛推廣的赤芝品種之一，因其具有抗病性好、孢子粉產(chǎn)量高等優(yōu)點，深受各地菇農(nóng)喜愛。

多糖是靈芝的主要活性成分之一，在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)方面起著重要作用［4-6］。至今已從靈芝子實體、孢子粉、發(fā)酵菌絲體和胞外液中分離獲得200多個多糖組分［7］，其中大部分為雜多糖和葡聚糖。據(jù)報道［8-9］，靈芝品種對多糖含量乃至結構都有明顯影響。為了進一步分析“滬農(nóng)靈芝1號”子實體中的多糖成分，作者以高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射儀-示差折光檢測儀聯(lián)用分析技術對其中的大相對分子質(zhì)量多糖組分的分子特征進行了分析，并建立了高效液相色譜法測定其多糖含量，為靈芝的進一步開發(fā)利用和質(zhì)量控制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

滬農(nóng)靈芝1號靈芝菌株，由浙江龍泉基地栽培獲得子實體。

1.2試劑

標準單糖D-半乳糖，D-葡萄糖，D-阿拉伯糖，L-巖藻糖，L-鼠李糖，D-甘露糖，D-木糖：購自Sigma公司；葡聚糖Pullulan（P-50）標準品：購自Shodex公司；專一性內(nèi)切-1，3-β-D-glucanase（來源于Trichoderma sp，EC：3.2.1.39）：購自Megazyme公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3儀器

Waters2695型高效液相色譜儀：配有Waters2414示差折光檢測器（RI），Waters公司產(chǎn)品；激光光散射儀（MALLS）：Wyatt公司產(chǎn)品；高效陰離子色譜儀：Dionex公司產(chǎn)品。

1.4試驗方法

1.4.1靈芝多糖的純化參考文獻［10］，采用乙醇沉淀法純化靈芝大相對分子質(zhì)量多糖。稱取靈芝子實體粉100 g，加入1 L蒸餾水浸泡30 min后，煮沸提取1 h，過濾，殘渣重復提取1次，合并濾液。濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至100 mL，離心（8 000 g，15 min）去除殘渣，上清液加無水乙醇至乙醇終體積分數(shù)為20%，4℃放置12 h，倒去上清液，10 000 g離心10 min，沉淀用體積分數(shù)20%乙醇反復洗滌3次，離心去上清液，沉淀部分加20 mL蒸餾水溶解，80℃水浴加熱揮去乙醇后，經(jīng)冷凍干燥機干燥即得靈芝大相對分子質(zhì)量多糖。

1.4.2靈芝多糖純度鑒定及相對分子質(zhì)量分析采用苯酚-硫酸法［11］測定靈芝多糖的糖含量，以高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光散色儀-示差折光檢測儀聯(lián)用分析法（HPSEC-MALLS-RI System）對該靈芝多糖的純度和相對分子質(zhì)量進行分析［12］。具體色譜條件為：以TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm，TOSOH，日本）為分析柱，以0.15 mol/L NaNO3和0.05 mol/L NaH2PO4（pH=7）為流動相，在35℃條件下，以0.5 mL/min流速進行洗脫分析。樣品質(zhì)量濃度配制成5 mg/mL，12 000 g高速離心10 min后，取上清液進樣100 μL。其中8角度激光光散射儀的光源波長選用623.8 nm，多糖在溶液中的折光指數(shù)增量按照0.146 mL/g計算。使用Astra（version 6.1.1，Wyatt Technology，Santa Barbara，CA）數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進行采集和分析，計算相對分子質(zhì)量。

1.4.3多糖的單糖組成及連接方式分析按照文獻［13］方法，采用高效陰離子交換色譜分析法（HPAEC）對靈芝多糖的單糖組成進行分析。靈芝多糖經(jīng)甲基化處理后，以GC-MS分析其產(chǎn)物，確定糖殘基的主要連接方式［12］。

1.4.4高效液相色譜法定量分析大相對分子質(zhì)量靈芝多糖含量精密稱取靈芝子實體粉4 g，加入蒸餾水40 mL，沸水浴提取2 h，過濾離心后取20 mL提取液直接凍干。加入1 mL流動相使樣品充分溶解后，按照1.4.2項的色譜條件進行分析。以上述靈芝多糖為標準品，分別配成0.25、0.5、1、2、4 mg/ mL的濃度進樣，以示差折光檢測器所測峰面積對應多糖濃度做標準曲線，計算多糖含量。

1.4.5栽培方式對“滬農(nóng)靈芝1號”子實體中大相對分子質(zhì)量多糖含量的影響將“滬農(nóng)靈芝1號”品種進行袋料和段木栽培，收集子實體后按上述1.4.4項方法進行大相對分子質(zhì)量多糖含量測定，考察栽培方式對靈芝大相對分子質(zhì)量多糖含量的影響。

2　結果

2.1靈芝大相對分子質(zhì)量多糖的純化及相對分子質(zhì)量分析

“滬農(nóng)靈芝1號”子實體熱水提取物經(jīng)20%乙醇沉淀后獲得一組分，苯酚硫酸法檢測其多糖含量為94.3%。紫外掃描結果顯示該組分水溶液在280 nm處無紫外吸收峰，說明該組分為多糖，經(jīng)高效凝膠尺寸排阻色譜檢測，示差檢測器（RI）信號峰為單一峰，證明該多糖純度較高（圖1）。采用HPSECMALLS-RI技術對其相對分子質(zhì)量進行分析，以普魯蘭（P-50，重均相對分子質(zhì)量4.88×104）為標準品對各個角度的激光進行歸一化處理，計算該多糖重均相對分子質(zhì)量（Mw）為2.28×106。該多糖的相對分子質(zhì)量分布如圖2所示，經(jīng)分析其多分散系數(shù)（Mw/ Mn）為1.14，屬于窄分布樣品。

圖1　高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射儀-示差折光檢測儀聯(lián)用分析多糖組分Fig.1Light scattering and refractive index profiles from HPSEC-MALLS-RIexperimentsonthe polysaccharide fraction

圖2　多糖組分的相對分子質(zhì)量分布Fig.2Molar mass distribution of the polysaccharide fraction

均方根半徑（Rg）與重均相對分子質(zhì)量（Mw）間的關系如圖3所示，擬合曲線的斜率可以用來表征多糖在溶液中的構象。當斜率大于0.7時表示高分子在溶液中是棒狀排列，當斜率為0.5～0.6時則表示高分子在溶液中呈線性無規(guī)則線團，斜率約為0. 33時表示高分子為球狀形態(tài)［14］。由Astra處理軟件計算，該多糖的Rg值為（150.1±6.6）nm，擬合曲線的斜率為0.98±0.01，說明該多糖在流動相體系中呈現(xiàn)硬的棒狀排列。

圖3　多糖組分的Rg與Mw雙對數(shù)關系圖及擬合曲線Fig.3Double-logarithmic plot of Rgagainst Mwand the linear fitting curve for the polysaccharide fraction

2.2單糖組成及連接方式分析

高效陰離子交換色譜分析（HPAEC）結果表明，該靈芝多糖主要由葡萄糖組成。酶解試驗結果顯示，該多糖可以被專一性內(nèi)切-β-1，3-D-glucanase水解，判定該多糖為β構型。甲基化分析其連接方式結果顯示，該多糖主要包含3種主要連接方式的糖殘基（圖4），分別為末端葡萄糖殘基，1，3-連接的葡萄糖殘基和1，3，6-連接的葡萄糖殘基（表1），其摩爾比約為1∶2.1∶0.9，說明該多糖的結構是以β-1，3連接為主鏈、1，6-連接為支鏈的葡聚糖。

圖4　多糖的總離子流圖Fig.4Total ion chromatogram of the polysaccharide fraction

表1　多糖組分的甲基化分析結果Table 1Methylation analysis of the polysaccharide fraction

2.3大相對分子質(zhì)量靈芝多糖的含量測定

2.3.1標準曲線的建立以上述靈芝多糖為標準品，配制成不同濃度的溶液，使用示差折光檢測器（RI）測定對應濃度下多糖的峰面積，以多糖質(zhì)量濃度（X，mg/mL）對峰面積（Y）繪制標準曲線，得回歸方程，y=173 604x+3 862，r=0.999 6，線性質(zhì)量濃度范圍為0.5～4 mg/mL。

2.3.2栽培方式對“滬農(nóng)靈芝1號”子實體中大相對分子質(zhì)量多糖含量的影響分別收集在四川成都基地經(jīng)袋料和段木栽培獲得的“滬農(nóng)靈芝1號”子實體，對其大相對分子質(zhì)量多糖含量進行了測定，結果見表2。段木栽培所得子實體大相對分子質(zhì)量多糖含量為0.52 mg/g，顯著高于袋料栽培所得靈芝子實體中該組分的質(zhì)量分數(shù)（0.14 mg/g）。

表2　不同栽培方式所得靈芝子實體中大相對分子質(zhì)量多糖質(zhì)量分數(shù)測定（n=3）Table2Contentsoflargemolecularweight polysaccharideinthefruitingbodies obtained by different cultivation patterns

3　結語

通過簡單的乙醇沉淀法從“滬農(nóng)靈芝1號”子實體中分離獲得大相對分子質(zhì)量β-葡聚糖，與筆者從另一靈芝材料所得葡聚糖［10］結構相同，均以β-（1，3）-連接為主鏈、β-（1，6）-連接為支鏈，其構象特征也相似，但相對分子質(zhì)量大小略有不同。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，分類學上屬于不同種的靈芝，其多糖相對分子質(zhì)量分布有顯著差別，部分靈芝中未檢測到相對分子質(zhì)量為上百萬的水溶性多糖組分。另外，不同來源靈芝子實體所含大分子多糖的結構是否完全相同，仍需通過對這部分多糖的純化和結構解析來進行驗證。

據(jù)報道［9］，不同來源靈芝子實體多糖含量存在差異，但此種差異僅通過苯酚-硫酸法等化學方法檢測其總多糖含量來進行比較，沒有針對性。因為并非所有的多糖組分均具有明顯的生物活性，而β-（1，3）/（1，6）-葡聚糖在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等方面表現(xiàn)出較好的效果［15-16］，所以，化學方法所測總多糖含量高低不能完全反映靈芝子實體的品質(zhì)和多糖特征。作者以分離獲得的β-葡聚糖為標準品，建立了HPLC定量分析的檢測方法，為靈芝子實體品質(zhì)評價提供了參考。研究發(fā)現(xiàn)，段木栽培所得的靈芝子實體中β-葡聚糖含量顯著高于袋料栽培，這為靈芝子實體的生產(chǎn)提供了指導。

HPSEC-MALLS聯(lián)用技術是近些年興起的分析大分子聚合物的新技術，現(xiàn)已應用于多糖的相對分子質(zhì)量測定［17］。與原有的GPC分析法相比，此方法不需要標準品作對照，對多糖進行相對分子質(zhì)量測定時受樣品結構和構型的影響小，因此可以更準確地得到多糖的相對分子質(zhì)量信息。另外，此技術還可通過測定樣品在溶液狀態(tài)下的各項參數(shù)來分析其構象特征，為進一步研究多糖的構效關系提供有用信息。

［1］林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究（第二版）［M］.北京：北京醫(yī)科大學出版社，200l.

［2］楊曉麗，地里熱巴·沙它爾，李翔，等.靈芝超微粉理化特性研究［J］.食品與生物技術學報，2013，32（1）：69-74.

YANG Xiaoli，DILIREBA Sha-taer，LI Xiang，et al.Physicochemical properties of ultrafine Garnoderma lucidum powder［J］. Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（1）：69-74.（in Chinese）

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［4］劉高強，王曉玲.靈芝免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用的研究進展［J］.菌物學報，2010，19（1）：152-158.

LIU Gaoqiang，WANG Xiaoling.Advances in studies on immunomodulating and anti-tumor effects of Ganoderma lucidum［J］. Mycosystema，2010，19（1）：152-158.（in Chinese）

［5］NIE Shaoping，ZHANG Hui，LI Wenjuan，et al.Current development of polysaccharides from Ganoderma：Isolation，structure and bioactivities［J］.Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre，2013，1：10-20.

［6］郝瑞芳，李榮春.靈芝多糖的藥理和保健作用及應用前景［J］.食用菌學報，2004，11（4）：57-62.

HAO Ruifang，LI Rongqing.Pharmacological and health effect of Ganoderma lucidum polysaccharide and its application prospect［J］.Acta Edulis Fungi，2004，11（4）：57-62.（in Chinese）

［7］HUIE Carmen，DI Xin.Chromatographic and electrophoretic methods for Lingzhi pharmacologically active components［J］. Journal of Chromatography B，2004，812（1-2）：241-257.

［8］史俊青，張麗萍，楊春清，等.不同品種靈芝多糖含量差異研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（13）：104-106.

SHI Junqing，ZHANG Liping，YANG Chunqing，et al.Study on polysaccharide content in two different variety of Ganoderma lucidum［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2010，16（13）：104-106.（in Chinese）

［9］徐凌川，許昌盛.18種不同來源靈芝的多糖含量測定［J］.世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2004，6（2）：57-60.

XU Lingchuan，XU Changsheng.Determination of content of polysaccharides of 18 varieties of Ganoderma lucidum Karst with different origins［J］.World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica，2004，6（2）：57-60.（in Chinese）

［10］LIU Yanfang，ZHANG Jingsong，TANG Qingjiu，et al.Physicochemical characterization of a high molecular weight bioactive β-D-glucan from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum［J］.Carbohydrate Polymers，2014，101：968-974.

［11］張惟杰.糖復合物生化研究技術（第2版）［M］.杭州：浙江大學出版社，1999.

［12］LIU Yanfang，ZHAO Yuan，YANG Yan，et al.Structural characteristics and hypoglycemic activity of polysaccharides from Coprinus comatus［J］.Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre，2013，2：164-169.

［13］楊仁智，張勁松，唐慶九，等.高效陰離子交換色譜法測定毛頭鬼傘多糖中的單糖組成［J］.中國食用菌，2005，24（5）：42-44.

YANG Renzhi，ZHANG Jingsong，TANG Qingjiu，et al.High performance anion exchange chromatography method to determine the monosaccharide composition of polysaccharides［J］.Edible Fungi of China，2005，24（5）：42-44.（in Chinese）

［14］YANG Liqun，ZHANG Liming.Chemical structural and chain conformational characterization of some bioactive polysaccharides isolated from natural sources［J］.Carbohydrate Polymers，2009，76：349-361.

［15］Akramiene，Dalia.，Kondrotas，Aantolijus，Didziapetriene，Janina，et al.Effects of beta-glucans on the immune system［J］. Medicina（Kaunas），2007，43（8）：597-606.

［16］CHEN Jiezhong，SEVIOUR Robert.Medicinal importance of fungal β-（1→3），（1→6）-glucans［J］.Mycological Research，2007，111：635-652.

［17］陳同強，ADILBEKOV J，王娟，等.凝膠滲透色譜-多角度激光散射聯(lián)用技術研究紅芪多糖中4個組分分子特征［J］.中國中藥雜志，2012，37（12）：1798-1802

CHEN Tongqiang，ADILBEKOV J，WANG Juan，et al.Study on molecular characteristics of four components contained in Hedysari Radix polysaccharide by gel permeation chromatography-multi angle laser light scatting technology（GPC-MALLS）［J］. China Journal of Chinese Materia Medica，2012，37（12）：1798-1802.（in Chinese）

Analysis of Large Molecular Weight Polysaccharide in the Fruiting Bodies of Ganoderma lucidum Cultivar‘Hunonglingzhi 1’

LIU Yanfang1，2，TANG Qingjiu*1，ZHANG Jingsong1，Steve W.Cui2，3，YANG Yan1，WU Di1，ZHOU Shuai1，TANG Chuanhong1，ZHANG Zhong1，YAN Mengqiu1
（1.National Engineering Research Center of Edible Fungi；Key Laboratory of Applied Mycological Resources and Utilization，Ministry of Agriculture；Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；2.School of Chemical and Materials Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Guelph Food Research Centre，Agriculture and Agri-Food Canada，Guelph，N1G 5C9，Canada）

The high molecular polysaccharide fraction was purified by precipitating a hot-water extract with 20%（V/V）ethanol from fruiting bodies of Ganoderma lucidum cultivar'Hunonglingzhi 1'.The high performance size exclusion chromatography-multiple angle laser light scatteringrefractiveindexdetector（HPSEC-MALLS-RI）wasadoptedtodeterminethemolecular characteristics of this fraction.Results indicated that the polysaccharide possessed high weight average molecular weight（Mw）of 2.28×106，small polydispersity of 1.14 and large gyration radius（Rg）of 150.1 nm，and existed with a rigid chain conformation in the liquid solution.Structuralanalysis showed that this polysaccharide was a β-（1，3）/（1，6）-linked D-glucan.Its content determined by HPLC in wood cultivated fruiting bodies was about 0.52 mg/g，which was significantly higher than that in bag cultivated pattern.

polysaccharide of Ganoderma lucidum，MALLS，molecular character

S 646

A

1673—1689（2015）10—1078—05

2014-10-08

上海市科委國際合作項目（13540721901）；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303080）。

劉艷芳（1980—），女，山東曲阜人，化學工程博士研究生，副研究員，主要從事真菌多糖化學研究。E-mail：aliu-1980@163.com

唐慶九（1969—），女，江蘇鹽城人，理學博士，研究員，主要從事天然產(chǎn)物化學和藥理學研究。E-mail：tangqingjiu@saas.sh.cn