何文森，王慧慧，張金庫，蘇春燕，馬海樂，賈承勝，馮骉

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

SDS+HCl催化合成親水性植物甾醇酯

何文森1，王慧慧1，張金庫1，蘇春燕1，馬海樂1，賈承勝2，馮骉2

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

作者通過兩步法將植物甾醇與聚乙二醇結合，即植物甾醇先與琥珀酸酐反應合成植物甾醇琥珀酸單酯（簡稱單酯），后者再與聚乙二醇酯化制備新型親水性植物甾醇酯（植物甾醇聚乙二醇琥珀酸二酯，簡稱二酯）。考察了膠束催化劑對二酯合成的影響，研究了反應條件對轉化率的影響。結果表明，十二烷基硫酸鈉加鹽酸為合成親水性植物甾醇酯的高效催化劑。在催化劑用量為質量分數(shù)6%，單酯與聚乙二醇摩爾比為1∶2，140℃下反應2 h目標產(chǎn)物的轉化率可達96%。

植物甾醇；親水性；聚乙二醇；十二烷基硫酸鈉

植物甾醇是植物中天然存在的一種微量活性成分，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇4種。植物甾主要存在于谷物、豆類、種子、水果、蔬菜、堅果及其副產(chǎn)品。目前，植物油精煉過程產(chǎn)生的脫臭餾出物是植物甾醇的主要來源；另外，造紙業(yè)副產(chǎn)物妥爾油也含有大量的植物甾醇，是植物甾醇的另一重要來源［1-2］。

研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇主要通過抑制膽固醇在小腸內的吸收，可以有效降低血液TC及LDL-C含量，而對人體有益的HDL-C含量卻沒有影響［3］。近年來還發(fā)現(xiàn)植物甾醇具有抗腫瘤、降低心臟病發(fā)生率、抗氧化、抗癌、消炎、退熱、防止前列腺疾病、提高免疫力、皮膚保健和美容等多種重要的生理功能［4-8］，可廣泛應用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)。因此，植物甾醇正受到國內外越來越多的重視。

植物甾醇常溫下為結晶形式，其生物可利用性較差。植物甾醇獨特的化學結構決定了它具有不溶于水、油溶性低和熔點高等特點，極大地限制了其實際應用。截至目前，大量研究將植物甾醇與脂肪酸或脂肪酸酯通過直接酯化或酯交換反應生成植物甾醇酯，以改善植物甾醇的油溶性，拓寬它在油脂或富含脂肪食品中的應用。Pan等先將Candida sp.99-125脂肪酶固定化處理，后用于植物甾醇油酸酯的合成，最高產(chǎn)率可以到達93%［9］。Zheng等將Candida rugosa脂肪酶通過環(huán)氧基固定在磁性微球上，利用此固定酶合成植物甾醇亞麻酸酯，在酸醇摩爾比為2∶1，55℃下反應15 h，最高酯化率可達93%［10］。目前中國市場上已有許多添加植物甾醇或甾醇酯的油脂產(chǎn)品，如金龍魚植物甾醇玉米油、福臨門植物甾醇玉米油、多利甾醇玉米油等。

曾有人利用包埋、微乳、噴霧干燥等物理方法制備富含植物甾醇的相關產(chǎn)品，以改善植物甾醇在水相體系的分散性。Wai-Fun Leong等利用溶劑置換法制備甾醇微乳液，得到微乳液最小粒徑為328 nm，PDI為0.16［11］。Alexander等利用大豆磷脂將植物甾醇制成納米脂質體，當磷脂與甾醇質量比為14∶1和13∶2時制得的脂質體平均粒徑為115 nm和150 nm［12］。盡管可在一定程度上改善植物甾醇類化合物在水中的分散性，但通過這些方法制備的植物甾醇類食品具有穩(wěn)定性差等缺點，會影響食品的感官品質、食用價值和質量安全，不利于產(chǎn)品的長期儲存。

目前，國內外鮮有通過分子修飾的方法改善植物甾醇水溶性或親水性的研究報道。作者以琥珀酸酐為偶聯(lián)劑，聚乙二醇為修飾劑，通過兩步反應將植物甾醇與聚乙二醇結合制備親水性植物甾醇酯（植物甾醇聚乙二醇琥珀酸二酯，簡稱二酯），重點研究單酯與聚乙二醇反應制備二酯的合成工藝。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物甾醇（＞95%）：江蘇春之谷生物制品有限公司提供；無水乙醇、正己烷、石油醚（60～90℃）、甲酸、甲醇、異丙醇、乙酸乙酯、鹽酸為分析純、聚乙二醇（平均相對分子質量1 000，PEG）、十二烷基硫酸鈉：化學純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；柱層層析硅膠：購自青島海洋化工廠。

安捷倫1100高效液相色譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品；ZAM 4000蒸發(fā)光散射檢測器：德國Schambeck公司產(chǎn)品；DF-101S集熱式加熱攪拌器：常州普天儀器制造有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司產(chǎn)品；旋轉蒸發(fā)器RE-2000B：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；JA2003電子天平：上海上平儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2實驗方法

1.2.1植物甾醇琥珀酸單酯的制備植物甾醇琥珀酸單酯（簡稱單酯）的制備方法見參考文獻［13］。具體反應如下：取4.1 g植物甾醇，1.5 g琥珀酸酐分別加入圓底三口燒瓶，依次加入100 mL甲苯和體積分數(shù)1.5%吡啶分別作溶媒和催化劑，固定好冷凝回流管和溫度計，油浴加熱，回流狀態(tài)下反應24 h得單酯粗產(chǎn)品。經(jīng)高效液相色譜分析測得中間產(chǎn)物單酯的轉化率達91%。

1.2.2單酯的分離純化將60 g 100-200目柱層析硅膠G放入燒杯，加入250 mL洗脫溶劑，洗脫劑為v（石油醚）∶v（乙酸乙酯）∶v（甲酸）=5∶5∶0.01，充分攪勻，室溫下浸泡2 h。將充分浸泡的硅膠緩緩裝入擴口層析柱（D1.2 cm×80 cm），避免氣泡出現(xiàn)，待硅膠充分沉降后，靜置一晚，待用。

將0.8 g樣品溶于5 mL洗脫溶劑，上樣，用洗脫劑洗脫硅膠柱，用自動收集器收集洗脫液，10 min/管，并用薄層色譜分析跟蹤洗脫產(chǎn)物，將比移值一致的產(chǎn)物合并收集，將分離純化后的單酯純品用作后續(xù)反應的原料。

1.2.3催化劑的制備稱取適量的十二烷基硫酸鈉（SDS）放入研缽中，在通風櫥中滴加過量鹽酸（HCl），研磨大約3 min后，靜置約5 min，使SDS與HCl充分接觸反應，生成十二烷基硫酸（SDS+HCl），備用。催化劑為每次實驗前現(xiàn)配。

1.2.4二酯的制備稱取一定量的聚乙二醇加入反應試管，置于溫度恒定的油浴磁力攪拌加熱裝置，開啟磁力攪拌，待樣品完全熔化后再依次加入單酯、催化劑、通入氮氣，開始計時反應。

1.2.5高效液相色譜分析稱取待分析產(chǎn)物溶于無水乙醇，配成一定質量濃度的溶液（1～2 mg/mL），用注射器吸取大約1 mL溶液，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后分析。高效液相色譜系統(tǒng)，包括高效液相色譜儀、蒸發(fā)光散射檢測器和N2000數(shù)據(jù)處理軟件。色譜柱為美國Waters公司的symmetry C18反相柱（D 4.6 mm×150 mm，5 μm），v（甲醇）∶v（甲酸）=1 000∶1，進樣量為10 μL。蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)：溫度為60℃，載氣為氮氣，壓力為0.2 MPa。其中，分析植物甾醇與琥珀酸酐反應物的流量為0.6 mL/min，柱溫25℃。分析純植物甾醇琥珀酸單酯、聚乙二醇、催化劑SDS+HCl以及植物甾醇琥珀酸單酯與聚乙二醇反應物所用流量均為1.0 mL/min，柱溫35℃。

單酯轉化率（%）=單酯的峰面積/（植物甾醇的峰面積+單酯的峰面積）×100%

二酯轉化率（%）=二酯的峰面積/（單酯的峰面積+二酯的峰面積）×100%

2　結果與討論

2.1高效液相色譜分析

圖1是植物甾醇與琥珀酸酐反應混合物的高效液相色譜圖。流動相為含有體積分數(shù)1%甲酸的甲醇溶液，流速為0.6 mL/min，柱溫為25℃。由圖可知，琥珀酸酐保留時間為4.8 min，植物甾醇琥珀酸單酯的保留時間主要集中在21～26 min，植物甾醇的保留時間主要集中在27～30 min。植物甾醇主要包含4種成分，即β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇，故植物甾醇丁二酸單酯也含有四種，分別為β-谷甾醇丁二酸單酯、豆甾醇丁二酸單酯、菜油甾醇丁二酸單酯和菜籽甾醇丁二酸單酯。由圖可知，植物甾醇琥珀酸單酯與植物甾醇具有類似的峰型結構。β-谷甾醇保留時間為30.4 min，β-谷甾醇丁二酸單酯對應26.8 min。豆甾醇保留時間為29.1 min，豆甾醇丁二酸單酯對應25.5 min。菜油甾醇保留時間為27.7 min，菜油甾醇琥珀酸單酯對應24.6 min。菜籽甾醇含量較低，保留時間小于26 min，色譜峰與單酯重合，而菜籽甾醇琥珀酸單酯對應21.8 min。

圖1　植物甾醇與琥珀酸酐反應混合物的高效液相色譜圖Fig.1High performance liquid chromatogram of reaction mixture of phytosterols with succinic anhydride

圖2（a）是反應原料聚乙二醇的高效液相色譜圖。由圖可知，聚乙二醇的保留時間為2.74 min。圖2（b）是純的植物甾醇琥珀酸單酯的高效液相色譜圖。由圖可知，植物甾醇琥珀酸單酯的保留時間主要集中在9～12 min。因為植物甾醇主要包含4種成分，故植物甾醇丁二酸單酯也含有4種主要成分，分別為β-谷甾醇丁二酸單酯、豆甾醇丁二酸單酯、菜油甾醇丁二酸單酯和菜籽甾醇丁二酸單酯。由圖2（b）可知，β-谷甾醇丁二酸單酯的保留時間為11.69 min，豆甾醇丁二酸單酯的保留時間為11.09min，菜油甾醇丁二酸單酯的保留時間為10.72 min，菜籽甾醇丁二酸單酯的保留時間為9.60 min。圖2（c）是催化劑SDS+HCl的高效液相色譜圖。由圖可知，SDS-HCl的保留時間為2.39 min。

圖3是植物甾醇琥珀酸單酯與聚乙二醇反應混合物的高效液相色譜圖。通過與圖2對比發(fā)現(xiàn)，圖3中出現(xiàn)了一個新的色譜峰，說明植物甾醇琥珀酸單酯與聚乙二醇在SDS+HCl催化作用下生成了新的產(chǎn)物。聚乙二醇是一種混合物，相對分子質量分布較廣，這與產(chǎn)物呈現(xiàn)出較寬的色譜峰型吻合。由此可初步判定，新出現(xiàn)的色譜峰對應產(chǎn)物植物甾醇聚乙二醇丁二酸二酯。由圖可知，產(chǎn)物與反應原料以及催化劑可以明顯地分開。

圖2　聚乙二醇（a），植物甾醇丁二酸單酯（b），SDS+HCl（c）的高效液相色譜圖Fig.2High performance liquid chromatograms of PEG（a），phytosterol hemisuccinate（b）and SDS+HCl（c）

圖3　植物甾醇琥珀酸單酯與聚乙二醇反應混合物的高效液相色譜圖Fig.3High performance liquid chromatogram of reaction mixture of phytosterol hemisuccinate with PEG

2.2催化劑種類

研究發(fā)現(xiàn)，膠束催化劑十二烷基硫酸鹽可以有效催化植物甾（烷）醇脂肪酸酯的合成，以改善其油溶性［14-17］。作者首次將十二烷基硫酸鹽催化劑用于親水性植物甾醇酯的合成研究。在預實驗基礎上，對比研究了SDS，HCl，SDS+HCl對二酯的合成影響，結果見圖4所示。由圖可知，SDS和SDS+HCl均能催化二酯的合成。SDS是一種陰離子表面活性劑，其催化機理可能與膠束催化有關。同樣條件下，以SDS為催化劑時產(chǎn)物的轉化率達50%，而SDS+HCl做催化劑時，產(chǎn)物的轉化率可達60%。SDS+HCl的催化效率高于SDS，這可能是由于SDS與HCl結合后，更易形成膠束，從而使得反應轉化率提高。當以HCl為催化劑時，幾乎無二酯生成，這主要是由于HCl是易揮發(fā)性酸，沸點僅為57℃，在反應過程中，很快被載氣氮氣帶走。

馬媛等發(fā)現(xiàn)SDS用于催化合成亞油酸甾烷醇酯，在酸醇摩爾比3∶1，催化劑用量3%，150℃下反應時間5 h，產(chǎn)物轉化酯化率達到81.2%［16］。董濤等以SDS+HCl為催化劑，成功合成了植物甾醇月桂酸酯。在酸醇摩爾1.4∶1，催化劑用量為質量分數(shù)1.5%，120℃下反應4 h，產(chǎn)物轉化率可達87%［14］。因此，選擇SDS+HCl為后續(xù)反應催化劑。

圖4　催化劑種類對轉化率的影響Fig.4Effect of different catalysts on the conversion of the product

2.3反應溫度

溫度是影響酯化反應的一個重要因素。本反應體系為無溶劑體系，因此反應溫度至關重要。溫度過低，底物不能熔化，酯化反應無法進行。聚乙二醇的熔點在60℃左右，而植物甾醇琥珀酸單酯的熔點高達160℃。因此，最低反應溫度選為100℃。圖5是不同反應溫度對二酯轉化率的影響。由圖可知，反應溫度為100℃時，二酯的轉化率很低，不足40%。在100℃時聚乙二醇可以熔化成液態(tài)，但單酯不能完全溶解在液態(tài)聚乙二醇，底物之間的有效碰撞機會較少，從而影響產(chǎn)物的轉化率。隨著反應溫度的升高，轉化率逐漸增加；當反應溫度增加到140℃時，轉化率可達80%。雖然尚未達到單酯完全熔化的溫度，但距熔化溫度較近，在液態(tài)聚乙二醇的“溶解”下，底物已變?yōu)橐簯B(tài)，這有助于酯化反應的進行。進一步增加反應溫度，二酯轉化率沒有顯著變化。因此，反應溫度以140℃為宜。

圖5　不同反應溫度下的轉化率Fig.5Effect of reaction temperature on the conversion of the product

2.4催化劑用量

催化劑用量對二酯轉化率的影響如圖6所示。添加適量催化劑有利于酯化反應的進行，但并非加入量越大，催化效果就越好。由圖可知，催化劑用量為底物質量的4%時，產(chǎn)物轉化率不足80%。增加催化劑用量，產(chǎn)物轉化率逐漸增加，當催化劑用量為6%時，產(chǎn)物轉化率達83%。繼續(xù)增加催化劑用量，二酯轉化率沒有明顯提高。這主要是由于在熔融液態(tài)下，適量的催化劑與底物能實現(xiàn)充分地接觸。催化劑用量過高，不但不能提高二酯轉化率，反而會增加成本。因此，催化劑用量以單酯質量的6%為宜。

圖6　不同催化劑用量的轉化率Fig.6Effect of catalyst dose on the conversion of the product

2.5底物摩爾比

聚乙二醇與單酯的摩爾比對轉化率的影響如7所示。由圖可知，隨著聚乙二醇與單酯的摩爾比增加，二酯的轉化率逐漸增加。這是因為，酯化反應是一個可逆反應，增加其中一種反應底物的用量，有助于促進另外一種底物的轉化。當聚乙二醇與單酯的摩爾比為2∶1時，產(chǎn)物的轉化率較高，此時為88%。繼續(xù)增加聚乙二醇的摩爾用量，產(chǎn)物的轉化率變化不明顯，這是由于酯化反應趨于平衡。因此，聚乙二醇與單酯的最適摩爾比為2∶1。

圖7　不同反應物摩爾比的轉化率Fig.7Effect of the molar ratio of PEG to hemisuccinate on the conversion of the product

2.6反應時間

在前面各最優(yōu)條件下，考察反應時間對產(chǎn)物轉化率的影響，結果如圖8所示。由圖可知，隨著反應時間的延長，底物反應越徹底，二酯的轉化越高。由圖11可以看出，反應1 h產(chǎn)物的轉化率可達87%；反應2 h二酯的轉化率可達96%。繼續(xù)延長反應時間，二酯轉化率沒有明顯提高，說明反應2 h已接近平衡。

圖8　不同反應時間對轉化率的影響Fig.8Effect of reaction time on the conversion of the product

3　結語

作者通過兩步法成功合成了親水性植物甾醇酯（植物甾醇聚乙二醇琥珀酸二酯），即用植物甾醇與琥珀酸酐合成單酯，后者再與聚乙二醇結合。重點通過單因素試驗考察了以SDS+HCl為催化劑對二酯合成的影響，結果發(fā)現(xiàn)：在催化劑用量為質量分數(shù)6%，單酯與聚乙二醇摩爾比為1∶2，140℃下反應2 h二酯的轉化率可達96%，說明SDS+HCl是一種合成親水性植物甾醇酯的高效催化劑。

［1］Moreau Robert A，Whitaker Bruce D，Hicks Kevin B.Phytosterols，phytostanols，and their conjugates in foods：structural diversity，quantitative analysis，and health-promoting uses［J］.Progress in Lipid Research，2002，41：457-500.

［2］Fernandes P，Cabral J M S.Phytosterols：applications and recovery methods［J］.Bioresource Technology，2007，98：2335-2350.

［3］Smet Els De，Mensink Ronald P，Plat Jogchum.Effects of plant sterols and stanols on intestinal cholesterol metabolism：suggested mechanisms from past to present［J］.Molecular Nutrition and Food Research，2012，56：1058-1072.

［4］BrufauGemma，CanelaMiguel Angel，Rafecas Magda.Phytosterols：Physiologicandmetabolicaspectsrelatedto cholesterol-lowering properties［J］.Nutrition Research，2008，28：217-225.

［5］Bradford Peter G，Awad Atif B.Phytosterols as anticancer compound［J］.Molecular Nutrition and Food Research，2007，51：161-170.

［6］Rudkowska Iwona.Plant sterols and stanols for healthy ageing［J］.Maturitas，2010，66：158-162.

［7］Tan Zhuliang，Le Khuong，Moghadasian Mohammed，et al.Enzymatic synthesis of phytosteryl docosahexaneates and evaluation of their anti-atherogenic effects in apo-E deficient mice［J］.Food Chemistry，2012，134：2097-2104.

［8］Tan Zhuliang，Shahidi Fereidoon.A novel chemoenzymatic synthesis of phytosteryl caffeates and assessment of their antioxidant activity［J］.Food Chemistry，2012，133：1427-1434.

［9］Pan Xinxin，Chen Biqiang，Wang Juan，et al.Enzymatic synthesizing of phytosterol oleic esters［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，168：68-77.

［10］Zheng Ming-Ming，Dong Ling，Lu Yong，et al.Immobilization of Candida rugosa lipase on magnetic poly（allyl glycidyl ether-co-ethylene glycol dimethacrylate）polymer microsphere for synthesis of phytosterol esters of unsaturated fatty acids［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2012，74：16-23.

［11］Leong WAI FUN，Man Yaakob B.Che，Lai Oi Ming，et al.Optimization of processing parameters for the preparation of phytosterol microemulsions by the solvent displacement method［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57：842-8433.

［12］Alexander M，Lopez A Acero，F(xiàn)ang Y，et al.Incorporation of phytosterols in soy phospholipids nanoliposomes：Encapsulation efficiency and stability［J］.LWT-Food Science and Technology，2012，47：427-436.

［13］He Wen-Sen，Li Jing-Jing，Pan Xiao-Xia，et al.Lipase-mediated synthesis of water-soluble plant stanol derivatives in tert-butanol［J］.Bioresource Technology，2012，114：1-5.

［14］賈承勝，張印，徐菁苒，等.植物甾醇脂肪酸酯的膠束催化合成研究［J］.食品與生物技術學報，2011，30（6）：894-898. JIA Chengsheng，ZHANG Yin，XU Jinran，et al.Synthesis of phytosterol fatty acid esters using micelle-catalyst［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（6）：894-898.（in Chinese）

［15］董濤，賈承勝，張曉鳴.SDS催化合成植物甾醇月桂酸酯的研究［J］.食品與機械，2008，24（3）：44-47. DONG Tao，JIA Chengsheng，ZHANG Xiaoming.Synthesis of phytosterol laurate catalyzed by SDS［J］.Food&Machinery，2008，24（3）：44-47.（in Chinese）

［16］馬媛，賈承勝，張曉鳴，等.無溶劑直接酯化法合成亞油酸甾烷醇酯的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（6）：285-289. MA Yuan，JIA Chengsheng，ZHANG Xiaoming，et al.Synthesis of phytostanyl esters of linolic acid by direct esterification without solvent［J］.Science and Technology of Food Industry，2012，33（6）：285-289.（in Chinese）

［17］HE Wensen，MA Yuan，Pan Xiaoxia，et al.Efficient solvent-free synthesis of phytostanyl esters in the presence of acid-surfactant-combined catalyst［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60：9763-9769.

SDS+HCl Catalyzed Synthesis of Hydrophilic Phytosterol Esters

HE Wensen1，WANG Huihui1，ZHANG Jinku1，SU Chunyan1，MA Haile1，JIA Chengsheng2，F(xiàn)ENG Biao2
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The present study was to synthesize novel hydrophilic phytosterol esters through an intermediate phytosterol hemisuccinate，which was first prepared with phytosterols and succinic anhydride and subsequently coupled with polyethylene glycol.The effects of micelle catalyst and reaction conditions were investigated.Results showed that the combination of sodium lauryl sulfate and hydrochloric acid was highly efficient in the catalysis for the ester synthesis.The optimum reaction conditions were：6%catalyst dose（w/w），1∶2 molar ratio of phytosterol hemisuccinate to phytosterol polyethylene glycol succinate at 140℃for 2 h.With the optimum conditions，the conversion reached above 96%.

phytosterols，hydrophilic，polyethylene glycol，sodium lauryl sulfate

TS 229

A

1673—1689（2015）10—1020—07

2014-12-26

國家自然科學基金項目（31401664）；中國博士后科學基金（2014M560406）；江蘇大學高級人才科研啟動基金（13JDG070）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目。

何文森（1985—），男，四川巴中人，工學博士，講師，碩士研究生導師，主要從事食品科學研究。E-mail：wshe2013@163.com