劉永青任琳張子鋒

（1.呂梁學(xué)院，離石 033000；2.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，西安 710049）

大腸桿菌menA敲除對CoQ積累的影響研究

劉永青1，2任琳1張子鋒1

（1.呂梁學(xué)院，離石 033000；2.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，西安 710049）

通過同源重組敲除大腸桿菌的menA基因，增加菌體CoQ合成量，用于構(gòu)建CoQ高產(chǎn)菌株。以pKD4質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增kanr片段；在pKD46的輔助下，kanr片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用抗生素篩選和PCR驗證重組子；以紫外誘變菌為對照，發(fā)酵menA基因敲除菌株，分析CoQ種類和產(chǎn)量變化。成功獲得menA基因敲除菌株，CoQ種類不變，產(chǎn)量增加約為38%。首次敲除menA基因，改良株CoQ產(chǎn)量得到提高，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

大腸桿菌；基因敲除；menA基因；CoQ；同源重組

輔酶Q（CoQ）是一種脂溶性醌類衍生物，呼吸鏈上的電子傳遞體［1］。人體中主要以CoQ10的形式存在［2］，具有抗氧化、保護(hù)細(xì)胞膜完整、消除心血管治療中他汀類藥物導(dǎo)致的副作用等良好的生物學(xué)功能［3，4］，已成功地應(yīng)用于線粒體相關(guān)的多種疾病的治療、預(yù)防保健和化妝品等領(lǐng)域［5-11］。較之合成或提取法，微生物發(fā)酵法制備的CoQ生物活性高、無原材料限制、成本低無污染，成為CoQ生產(chǎn)的理想途徑［12，13］。但目前生產(chǎn)菌株缺乏，成為發(fā)酵生產(chǎn)的瓶頸，因此構(gòu)建CoQ高產(chǎn)菌株是實現(xiàn)CoQ發(fā)酵生產(chǎn)的必由之路［14］。

目前微生物發(fā)酵法選育CoQ高產(chǎn)菌株主要通過誘變育種和代謝工程育種實現(xiàn)。誘變育種包括基因誘變［15］和抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物誘變［16］。運用誘變手段雖然可使菌株發(fā)生突變，但目標(biāo)性不明確，需要無數(shù)次的變異才能達(dá)到目的，周期比較長，而且容易發(fā)生回復(fù)突變。Red同源重組技術(shù)是代謝工程育種的一種新興技術(shù)，可將一段抗性片段導(dǎo)入宿主菌細(xì)胞，利用λ噬菌體Red 重組酶的作用，使導(dǎo)入細(xì)胞的線性DNA 片段與染色體特定靶序列重組，靶基因被標(biāo)記基因置換下來。

本研究基于Red同源重組技術(shù)，經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)λ噬茵體的3個重組蛋白后，對pKD46介導(dǎo)的大腸桿菌CoQ合成旁路途徑［17，18］的關(guān)鍵基因1，4-二羥基-2-萘酸八異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因menA［19，20］進(jìn)行敲除，阻斷旁路途徑、積累側(cè)鏈前體IPP，搜尋能提高菌株CoQ含量的有效途徑，為日后構(gòu)建CoQ高產(chǎn)菌株積累經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；pkD4、pkD46由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈；10×PCR Buffer，10 mmol/mL dNTP，高保真Taq酶（10 U/μL），EB指示劑，6×loading buffer，DNA marker等均購自西安沃爾森；氨芐青霉素，卡納霉素，羅紅霉素，胰蛋白胨，瓊脂糖，無水氯化鈣，Tris，EDTA，酵母膏，瓊脂粉，牛肉膏等均購自交大物資中心；快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，PCR純化試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，基因組DNA提取試劑盒均購自大連寶生物。

1.2 方法

1.2.1 kanr片段擴(kuò)增 以pKD4質(zhì)粒作為模板設(shè)計帶有FRT位點的kanr基因引物，擴(kuò)增kanr片段用于menA基因的敲除。上游引物為GATGGGGCTGA AAGGCCCCATTTTTATTGGCGCGTATTATGAGGAATT AGCCATGGTCC，下游引物為TTGTTAATTGATATTT GTCAGTTATGCTGCCCACTGGCTTAGTAGGCTGGAGC TGCTTC。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min10 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.2 menA基因的敲除 活化大腸桿菌DH5α，OD600=0.2-0.4時用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。利用熱擊法將pKD46轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，32℃復(fù)蘇45 min，涂布于含青霉素（50 μg/mL）的LB平板上，32℃過夜培養(yǎng)。

挑選陽性克隆傳代，加L-阿拉伯糖（終濃度為0.1%），繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6，無菌條件下操作：冰浴15 min，4℃，2 500 r/min離心10 min，棄上清，分別用無菌水和500 μL 10%滅菌甘油冰上溫和清洗，重復(fù)前操作，溶于500 μL 10%滅菌甘油得制備DH5α（pKD46）感受態(tài)細(xì)胞。將kanr片段電轉(zhuǎn)化，電擊參數(shù)為：25 μF，200 Ω，2.5 kV，5 ms。32℃孵育1 h，涂布于含青霉素（50 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板上，32℃過夜培養(yǎng)［21］。挑取陽性單克隆，劃線接種于含氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上，轉(zhuǎn)接2次，驗證其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3 E.coli［menA］菌株的驗證 分別以穩(wěn)定傳代的E.coli［menA］和E.coli原始菌株基因組為模板，PCR擴(kuò)增驗證menA基因是否被敲除。上游驗證引物：ATGGCAGGTGAACGAATC；下游驗證引物1：CCATTTCCCGCATCACAT，下游驗證引物2：CAGTCATAGCCGAATAGC；PCR擴(kuò)增條件同前，退火溫度改變?yōu)?6.9℃。

1.2.4 大腸桿菌中CoQ的提取純化 制備流程：發(fā)酵液→4 000 r/min離心20 min收集菌體→真空冷凍干燥后稱重→90℃醇堿皂化30 min，同時加入焦性沒食子酸防止CoQ被氧化→石油醚萃取2次→超純水洗至pH7.0→無水Na2SO4干燥→-20℃冷凍1 h→過濾除雜→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥→10 mL無水乙醇定容→低溫保存待用。

1.2.5 menA基因敲除對CoQ種類和含量的影響測定

1.2.5.1 CoQ10標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 CoQ10標(biāo)準(zhǔn)曲線制備過程如下：配制0.2 mg/mL的CoQ10標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稀釋成5、10、15、20、25和30 μg/mL濃度，在275 nm處紫外檢測其吸收值［22］。

1.2.5.2 HPLC方法驗證CoQ種類 為了檢測基因敲除后是否造成CoQ種類的改變，在CoQ提取純化基礎(chǔ)上，對各菌株的提取液進(jìn)行了HPLC檢測，以大腸桿菌DH5α提取液作為CoQ8的保留時間標(biāo)準(zhǔn)對照。實驗參數(shù)［23，24］為：色譜柱為Agilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm）；流動相為95%無水乙醇：5%甲醇；流速l mL/min；檢測波長275 nm；溫度25℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.5.3 menA基因敲除對CoQ含量的影響測定 實驗以M9培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，需要情況下加入卡那霉素50 μg/mL，培養(yǎng)至對數(shù)中期（13 h），提取純化CoQ，采用紫外分光光度計法測定menA基因敲除菌株E.coli［menA］的CoQ含量，以出發(fā)菌株E.coli為對照。

1.2.6 紫外線誘變對CoQ含量的影響

1.2.6.1 菌懸液制備 分別取10 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的發(fā)酵液于6個無菌離心管中，4 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，沉淀用10 mL生理鹽水洗滌離心2次。

1.2.6.2 紫外線誘變 紫外燈預(yù)熱15 min，取6組菌懸液各0.1 mL注入LB平板中，涂布均勻。紫外燈照射條件：15 W，30 cm，照射時間分別為15、30、45、60、75、90 s，整個過程在暗室中完成。未經(jīng)照射的平板作為對照，每組3個平行。照射后立即取出，暗室中37℃培養(yǎng)24 h。將處理好的菌懸液做適當(dāng)稀釋，將細(xì)胞濃度控制在107-108個/mL。

1.2.6.3 初篩 根據(jù)致死率曲線，取對菌株致死率為70%-80%的處理時間進(jìn)行誘變［25］。吸取0.1 mL菌懸液涂布于羅紅霉素篩選平板上，進(jìn)行紫外照射。挑選長勢好的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.6.4 復(fù)篩 經(jīng)初篩挑選的突變株，種子液中過夜培養(yǎng)，按2%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)液，37℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)期，按方法1.5提取COQ，采用紫外分光光度計法測定突變菌株CoQ含量。

2 結(jié)果

2.1 kanr線性片段的擴(kuò)增

設(shè)計kanr基因的擴(kuò)增引物，以pKD4質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR。帶有FRT位點的kanr基因凈長1 496 bp，加上兩端外延部分及menA基因同源臂共長1 636 bp（圖1），凝膠電泳結(jié)果（圖2）顯示擴(kuò)增產(chǎn)物與理論長度相符。

圖1 kanr基因片段擴(kuò)增引物設(shè)計示意圖

圖2 kanr線性片段擴(kuò)增結(jié)果

2.2 kanr線性片段重組結(jié)果

抗性篩選結(jié)果顯示，對照組由于kanr基因未轉(zhuǎn)入，平板上沒有菌株生長；而轉(zhuǎn)入kanr基因的平板上有單菌落出現(xiàn)。以初步認(rèn)為此菌落是kanr基因重組成功菌株。從上述平板B中挑取陽性菌落，將單克隆接種于含氨芐青霉素、卡那霉素的LB培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其遺傳穩(wěn)定性良好。

將篩選到的目的菌株稀釋涂布接種在卡那霉素單抗培養(yǎng)基上，42℃過夜消除pKD46。將42℃下形成的單菌落分別接種于卡那霉素單抗培養(yǎng)基和氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性培養(yǎng)基上驗證抗性，選取在卡那霉素培養(yǎng)基上生長良好而氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性培養(yǎng)基無法生長的菌種，視為pKD46消除的E.coli［△menA］候選菌株進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

2.3 E.coli［△menA］重組子驗證

選取pKD46質(zhì)粒消除的待驗證E.coli［△menA］候選菌株，提取基因組DNA，用設(shè)計的兩對引物P3-P4和P3-P5分別對menA 基因敲除前后的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物擴(kuò)增到762 bp片段說明menA基因被kanr敲除，若用P3-P4引物擴(kuò)增到1 082 bp片段說明menA基因未被敲除。

擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖4）顯示，第2-5泳道為E.coli［△menA］候選菌株P(guān)CR結(jié)果，當(dāng)用P3-P4引物擴(kuò)增時，未能擴(kuò)增得到理論上的1 082 bp menA基因片段，說明menA基因不存在。當(dāng)用P3-P5引物擴(kuò)增時，獲得了762 bp的片段，與理論上推測的kanr替換menA結(jié)果一致，說明敲除成功。對照組E.coli菌株P(guān)CR結(jié)果（泳道6-9）顯示，P3-P4引物可以和E.coli菌株基因組模板特異結(jié)合，PCR產(chǎn)物大小為1 082 bp（泳道8，9）；而P3-P5引物擴(kuò)增的結(jié)果是無特異性條帶生成（泳道6，7）。通過menA 基因敲除前后菌株特異PCR產(chǎn)物的鑒定，認(rèn)為實驗構(gòu)建菌株即為E.coli［△menA］菌株，此構(gòu)建工作已順利完成。

圖3 E.coli［△menA］菌株P(guān)CR驗證示意圖

圖4 E.coli［△menA］重組子PCR驗證結(jié)果

2.4 紫外誘變

紫外誘變大腸桿菌的致死率曲線如圖5，隨著紫外照射時間延長，大腸桿菌致死率提高，當(dāng)紫外誘變時間為60 s時，致死率達(dá)到78%。下一步對紫外誘變60 s的正突變菌株進(jìn)行研究。

圖5 紫外誘變大腸桿菌的致死率曲線

取稀釋好的菌懸液涂于初篩培養(yǎng)基平板上，紫外處理60 s，37℃培養(yǎng)24 h，得突變菌落17株，挑選單菌落保存于斜面培養(yǎng)基，搖床復(fù)篩，測定突變株COQ產(chǎn)量。

2.5 menA基因敲除與紫外誘變對CoQ的影響測定

2.5.1 CoQ10標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用無水乙醇配制不同濃度的CoQ10標(biāo)準(zhǔn)品溶液，OD275nm處檢測其吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6。以CoQ10質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計算，得回歸方程為y=0.018x+0.008，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

圖6 CoQ10標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 menA基因敲除與紫外誘變對CoQ含量的影響測定 采用紫外分光光度計法分別測定menA基因敲除菌和突變株的CoQ含量，結(jié)果如表1所示，紫外誘變產(chǎn)生2株正突變株（編號為D1，D2），CoQ含量都有不同程度的提高，但相比于menA基因敲除菌，CoQ含量提高不大，故選定menA基因敲除菌作為候選菌株進(jìn)一步研究。

測定結(jié)果表明，menA敲除菌株在相同條件下，比出發(fā)菌CoQ含量明顯提高，提高幅度約為38%。2.5.3 CoQ種類驗證 分別以CoQ10標(biāo)準(zhǔn)品和原始大腸桿菌DH5α CoQ提取液作為CoQ8對照，對menA基因敲除菌CoQ提取物進(jìn)行了HPLC定性鑒定（圖7）。從圖7可以看出，CoQ10標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為7.1 min，原始大腸桿菌CoQ8提取液保留時間為5.6 min，根據(jù)保留時間可以判斷大腸桿菌menA基因敲除菌CoQ提取物中為CoQ8。

表1 menA基因敲除和紫外誘變對CoQ含量的影響

圖7 大腸桿菌menA基因敲除菌CoQ提取液的HPLC鑒定圖（保留時間min）

3 討論

維生素K2又稱甲基萘醌，也是一種芳香族醌類化合物，與CoQ擁有相同的底物分支酸和聚異戊烯長鏈。大腸桿菌維生素K2的合成途徑涉及到6個特定的基因，依次為menA，menB，menC，menD，menE和menF。分支酸先在menF編碼的分支酸異構(gòu)酶作用下變成異分支酸，然后在menD、menC、menB和menE基因編碼的相應(yīng)酶作用下生成1，4-二羥基-2-萘酸，最后在menA基因編碼的1，4-二羥基-2-萘酸八異戊烯基轉(zhuǎn)移酶作用下發(fā)生鏈環(huán)縮合，1，4-二羥基-2-萘酸和聚異戊烯長鏈連接成維生素K2。其中，menA基因編碼的酶是維生素K2合成過程中的限速酶。大腸桿菌既產(chǎn)CoQ又產(chǎn)維生素K2，因此可在兼性厭氧條件下生長。維生素K2作為大腸桿菌在厭氧條件下替代CoQ的電子傳遞載體，在好氧條件下并非細(xì)菌正常生長所必需的物質(zhì)。因此敲除menA基因可以使維生素K2合成底物聚異戊烯長鏈積累，使得CoQ合成前體增加，使反應(yīng)向CoQ合成的方向流動。同時維生素K2和CoQ都是脂溶性的膜定位活性物質(zhì)，抑制維生素K2的合成還可以留給CoQ更多的膜空間。加拿大學(xué)者Corinne在加拿大工業(yè)微生物學(xué)會年會摘要中報道了與本研究相似的大腸桿菌旁路基因敲除思路［20］，但尚未見研究結(jié)果報道。本實驗首次對menA基因進(jìn)行了敲除，并對其積累CoQ的能力進(jìn)行了測定，與預(yù)期結(jié)果相符，在豐富CoQ高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方面具有重要意義。menA基因敲除相較于紫外誘變方法穩(wěn)定性好，無回復(fù)突變，可短時間內(nèi)定向改造菌種，提高目標(biāo)產(chǎn)物量。

在此基礎(chǔ)上，可增加COQ合成過程中關(guān)鍵酶的表達(dá)提高COQ產(chǎn)量［26-28］。華東理工大學(xué)葉江等［29，30］對大腸桿菌UbiCA強化表達(dá)來提高COQ合成能力。改變COQ10合成途徑［31］主要包括兩個方面：通過重組聚十異戊二烯合成酶使大腸桿菌合成COQ10；將真核生物合成IPP的甲羥戊酸途徑重組入大腸桿菌，使IPP供應(yīng)能力加強。將脫氮副球菌的dps基因重組入大腸桿菌，使其獲得合成CoQ10的能力；或?qū)⒔湍负铣删凼愇於┑膇spB基因與大腸桿菌的ubiA基因在大腸桿菌中共表達(dá)，使CoQ10產(chǎn)量提高。華南理工大學(xué)李家洲等［32］將放射型根瘤菌ddsA基因替換大腸桿菌ispB基因并強化CoQ合成關(guān)鍵酶來提高CoQ10產(chǎn)量。要想獲得理想的代謝工程COQ生產(chǎn)菌株，應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)代謝通量分析，確定修飾和改造的靶點，多點協(xié)同改造。Xu［33］、劉建忠等［34，35］通過多基因策略、染色體工程改造大腸桿菌高效生產(chǎn)CoQ10取得了一定的效果。

發(fā)酵工藝優(yōu)化方面，有意識的控制培養(yǎng)基的溶氧或氧化還原電位，或在培養(yǎng)基中添加抑制呼吸作用的疊氮化合物，控制相對較高的pH值，都有助于提高COQ的產(chǎn)量。另外采取邊生產(chǎn)邊萃?。?6］的方法有助于降低生產(chǎn)過程中COQ對自身合成的反饋調(diào)節(jié)。江南大學(xué)金賽等［37］通過根癌土壤桿菌產(chǎn)輔酶Q10的補料分批發(fā)酵工藝使CoQ10產(chǎn)量得到大幅提高?？傊?，要實現(xiàn)COQ的工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)從多方面入手：生物合成途徑的探討、高產(chǎn)COQ大腸桿菌的構(gòu)建、高產(chǎn)菌株的選育、發(fā)酵工藝的優(yōu)化以及COQ提純檢測等下游技術(shù)的研究。

4 結(jié)論

首次成功敲除menA基因，大腸桿菌CoQ產(chǎn)量增加約38%，種類不變，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

［1］ Nohl H， Gille L. The bifunctional activity of ubiquinone in lysosomal membranes［J］. Biogerontology， 2002， 3（1-2）：125-132.

［2］ Cluis CP， Burja AM， Martin VJ. Current prospects for the production coenzyme Q10in microbes［J］. Trends in Biotechnology， 2007， 25（11）：514-521.

［3］ Kawamukai M. Biosynthesis， bioproduction and novel roles of ubiquinone［J］. J Biosci Bioeng， 2002， 94（6）：511-517.

［4］ Gille L. The Existence of a Lysosomal Redox Chain and the Role of Ubiquinone［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics， 2000， 375（2）：347-354.

［5］ Lenaz G， Fato R， Formiggini G， et al. The role of Coenzyme Q in mitochondrial electron transport［J］. Mitochondrion， 2007， 7：S8-S33.

［6］ Bentinger M， Dallner G， Chojnacki T， et al. Distribution and breakdown of labeled coenzyme Q10in rat［J］. Free Radic Biol Med， 2003， 34（5）：563-575.

［7］ Nohl H， Staniek K， Kozlov V， et al. The biomolecule ubiquinone exerts a variety of biological functions［J］. BioFactors， 2003， 18（14）：23-31.

［8］ Mizuno K， Tanaka M， Nozaki S， et al. Applied nutritional investigation Antifatigue effects of coenzyme Q10during physical fatigue［J］. Nutrition， 2008， 24：293-299.

［9］ Crane FL. Discovery of ubiquinone（coenzyme Q）and an overview of function［J］. Mitochondrion， 2007， 7S：S2-S7.

［10］ Turunen M， Olsson J， Dallner G. Metabolism and function of coenzyme Q［J］. Biochim Biophys Acta， 2004， 1660（1-2）：171-199.

［11］ 文涵. 輔酶Q10可減緩帕金森病的發(fā)展［J］. 國外醫(yī)學(xué)情報，2004， 25：17.

［12］ 黃偉， 徐建忠， 馮曉亮. 輔酶Q10研究新進(jìn)展［J］. 河南化工，2003（2）：12-15.

［13］ 張楠， 曹玉成. 輔酶Q10制備方法研究進(jìn)展［J］. 榆林學(xué)院院報，2006， 16（6）：12-14.

［14］ 王智文， 馬向輝， 陳洵， 等. 大腸桿菌CoQ10的代謝工程研究進(jìn)展［J］. 化工進(jìn)展， 2009， 28（5）：855-863.

［15］ 朱俊豐， 鄭方亮， 艾海新， 等. 微波結(jié)合紫外誘變選育輔酶Q10高產(chǎn)菌株［J］. 微生物學(xué)雜志， 2010， 30（2）：57-62.

［16］ 李繼揚， 丁妍， 周佩. 通過耐受前體或結(jié)構(gòu)類似物篩選提高輔酶Q10產(chǎn)量［J］. 復(fù)旦學(xué)報：醫(yī)學(xué)版， 2008， 35（3）：293-395，400.

［17］ Meganathan R. Biosynthesis of menaquinone（Vitamin K2）and ubiquinone（coenzyme Q）：a perspective on enzymatic mechanisms［J］. Vitam Horm， 2001， 61：173-218.

［18］ Ronald Bentley， Meganathan R. Biosynthesis of vitamin K（Menaquinone）in bacteria［J］. Microbiological Reviews， 1982，46（3）：241-280.

［19］ Dahm C， Mueller R， Schulte G， et al. The role of isochorismate hydroxymutase genes entC and menF in enterobactin and menaquinone biosynthesis in Escherichia coli［J］. Biochimica etBiophysica Acta， 1998， 1425：377-386.

［20］ Vincent J， Cluis C. Engineering E. coli for coenzyme Q10production：poster session2. SIM Annual Meeting and Exhibition of Society for Industrial Microbiology［C］. San Diego， 2008.

［21］ 韓聰， 張惟材， 游松. Red同源重組技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 中國生物工程雜志， 2003， 23（12）：17-21.

［22］ Tripodi V， Flor S， Contin M. Simple， Highly sensitive micro HPLC method for the determination of coenzyme Q10and its major related substances［J］. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies， 2009， 32：860-873.

［23］ Seo MJ， Im EM， Nam JY， et al. Increasse of CoQ10Production level by the coexpression of decaprenyl diphosphate synthase and 1-deoxyd-xylulose 5-phosphate synthase isolated from Rhizobium radiobacter ATCC 4718 in Recombinant Escherichia coli［J］. Microbiol Biotechnol， 2007， 17（6）：1045-1048.

［24］ Choi GS， Kim YS. Restricted electron flux increases coenzyme Q10production in Agrobacterium tumefaciens ATCC4452［J］. Process Biochemistry， 2005， 40：3225-3229.

［25］ 曹燕妮， 岳田利， 袁亞紅. 輔酶Q10高產(chǎn)菌株的誘變選育［J］.食品科學(xué)， 2012（11）：121-125.

［26］ 林丹楓， 李力， 柯崇榕， 等. 輔酶Q10的生物合成及其高表達(dá)研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通訊， 2012， 23（3）：465-469.

［27］ 孔卓怡， 鐘莉， 邱樂泉， 等. 基因工程策咯強化生物法生產(chǎn)CoQ10研究進(jìn)展［J］. 黑龍江科學(xué)， 2013， 7：45-47.

［28］ 邵慶偉， 柯崇榕， 楊威， 等. 輔酶Q10的微生物合成［J］. 生命的化學(xué)， 2013， 33（2）：91-95.

［29］ 葉江， 馬林， 吳海珍， 等. ubiCA基因的強化表達(dá)及對大腸桿菌輔酶Q生物合成的影響［J］. 華東理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2006， 32（3）：269-273.

［30］ 傅楠， 葉江， 吳海珍， 等. 基因替換及多基因共表達(dá)強化大腸桿菌輔酶Q10的合成能力［J］. 華東理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008， 34（5）：654-659.

［31］ 李家洲， 張冬青， 肖玉平， 等. 輔酶Q10生物合成與生產(chǎn)研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報， 2011（10）：37-42.

［32］ 李家洲， 謝明權(quán)， 李安興， 等. 產(chǎn)輔酶Q10大腸桿菌工程菌的構(gòu)建［J］. 華南理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2012， 40（5）：90-95.

［33］ Xu W， Yang S， Zhao J， et al. Improving coenzyme Q8production in Escherichia coli employing multiple strategies［J］. J Ind Microbiol Biotechnol， 2014， 41（8）：1297-303.

［34］ Huang MT， Wang Y， Liu JZ， et al. Multiple strategies for metabolic engineering of Escherichia coli for efficient prodution of coenzyme Q10［J］. Chinese Journal of Chemical Engineering， 2011， 19（2）：316-326.

［35］ Huang MT， Chen YY， Liu JZ， et al. Chromosomal engineering of Escherichia coli for efficient prodution of coenzyme Q10［J］. Chinese Journal of Chemical Engineering， 2014， 22（5）：559-569.

［36］ Zhong WH， Fang JJ， Liu HG， et al. Enhanced production of CoQ10by newly isolated Sphingomonas sp. ZUTEO3 with a coupled fermeantation-extraction process［J］. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology， 2009， 36（5）：687-693.

［37］ 金賽， 徐儉， 張梁， 等. 根癌土壤桿菌產(chǎn)輔酶Q10的補料分批發(fā)酵工藝［J］. 過程工程學(xué)報， 2011， 11（1）：113-116.

（責(zé)任編輯李楠）

The Influence of Knockout of menA Gene in Escherichia coli on the Accumulation of CoQ

Liu Yongqing1，2Ren Lin1Zhang Zifeng1
（1. Lüliang University，Lishi 033000；2. College of Life Science and Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049）

Knocking out menA gene of Escherichia coli by homologous recombination increases the synthetized amount of CoQ， which is used for constructing the strains of high-yield CoQ. Using pKD4 plasmid as template， the kanrfragments were amplified by PCR. In the presence of auxiliary plasmid pKD46， the kanrfragments were transformed into Escherichia coli， and the recombinant one was confirmed by antibiotic screening and verification of PCR；By contrast with uv-induced mutation， the strains with menA gene knocked out were fermented， and the types of CoQ and the changes of CoQ yield were analyzed. The results showed that the strains with menA gene knockout were successfully obtained，while the types of CoQ unchanged and the yield increased about 38%. In conclusion， this is the first time of knocking out menA gene， CoQ production of mutant strains is improved， and the desired goal is achieved， which lays a foundation for the further construction of high-yield CoQ strains.

Escherichia coli；gene knockout；menA genes；CoQ；homologous recombination

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.030

2015-06-10

呂梁市科技計劃項目（GG201330-2）

劉永青，男，碩士，研究方向：分子微生物；E-mail：liuyongqing07@163.com