谷月樸永哲，2杜維王小瑜王春艷

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116600）

不同溫度培養(yǎng)下釀酒酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)差異分析

谷月1樸永哲1，2杜維1王小瑜1王春艷1

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116600）

生物體在其生長(zhǎng)過(guò)程中要經(jīng)受一系列非生物環(huán)境的脅迫，這些脅迫條件都將影響細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)物等一系列的變化，以盡快適應(yīng)周?chē)兓沫h(huán)境。利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)考察了高溫脅迫對(duì)釀酒酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組的影響。結(jié)果表明，高溫脅迫的釀酒酵母FFC2146細(xì)胞壁蛋白質(zhì)中新增Ssa2和小分子鳥(niǎo)苷三磷酸酶，無(wú)機(jī)焦磷酸酶上調(diào)表達(dá)，而丙酮酸激酶缺消失，同時(shí)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶下調(diào)表達(dá)。上述結(jié)果說(shuō)明熱休克蛋白Ssa2保護(hù)細(xì)胞壁在高溫下保持完整，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖；高溫脅迫下釀酒酵母的糖酵解途徑受阻，在轉(zhuǎn)酮醇酶的作用下糖酵解途徑轉(zhuǎn)向磷酸戊糖途徑途徑，獲取足夠的能量，維持細(xì)胞正常的新陳代謝。

釀酒酵母；雙向電泳；熱激蛋白

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一類(lèi)被廣泛應(yīng)用的生產(chǎn)菌株，同時(shí)也是真核模式生物。它的非病原性以及用于生產(chǎn)消費(fèi)性產(chǎn)品（乙醇、面包等）的長(zhǎng)久歷史激發(fā)了人們對(duì)該微生物的研究興趣，同時(shí)它是公認(rèn)安全（generally regarded as safe，GRAS）的微生物。Saccharomyces cerevisiae發(fā)酵的最適溫度在28-33℃，一般不超過(guò)36℃。在發(fā)酵過(guò)程中，高溫會(huì)使蛋白變性，也會(huì)引起質(zhì)膜流動(dòng)性的變化，如高溫使磷脂分子在膜內(nèi)作快速的側(cè)向擴(kuò)散，使膜脂的流動(dòng)性增加，破壞膜的完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞的存活力迅速下降［1-3］。

自從 1962 年 Ritossa 首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)熱激現(xiàn)象（Heat shock）后，便成為研究酵母耐熱機(jī)制的一個(gè)重要領(lǐng)域。陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母經(jīng)不同程度的熱激后會(huì)產(chǎn)生不同種類(lèi)熱激蛋白（Heat shock proteins，HSP），酵母耐熱機(jī)制的研究則主要以熱激蛋白及生物耐熱性為中心。由于酵母的耐熱機(jī)制非常復(fù)雜，其研究方法也從經(jīng)典的遺傳學(xué)方法過(guò)渡到了分子生物學(xué)技術(shù)。最近幾年，已知的參與熱耐受的分子有熱激蛋白［4］、海藻糖［5］、應(yīng)激糖蛋白、膜結(jié)合 ATP 酶等，這些因素都在酵母耐熱機(jī)制中扮演著重要角色。

Saccharomyces cerevisiae在發(fā)酵過(guò)程中要經(jīng)受一系列的環(huán)境脅迫，如高溫、高糖以及不斷積累的乙醇，所有的這些脅迫條件都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和活性。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受這些脅迫時(shí)，復(fù)雜的生物代謝網(wǎng)絡(luò)中會(huì)發(fā)生一系列動(dòng)態(tài)的變化：包括基因、蛋白和代謝物等的變化［6］，以盡快的適應(yīng)周?chē)兓沫h(huán)境。

Saccharomyces cerevisiae的碳代謝途徑主要為糖酵解（EMP）途徑和戊糖磷酸（HMP）途徑，與之相關(guān)的酶系分布在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞壁上，其代謝調(diào)節(jié)及其復(fù)雜。研究表明與糖酵解有關(guān)的果糖-1，6-二磷酸激酶（Fructose-1，6-bisphosphatase），蘋(píng)果酸脫氫酶（Malate Dehydrogenase）等酶在細(xì)胞壁中發(fā)揮作用［7］。鑒于此本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)考察高溫對(duì)Saccharomyces cerevisiae細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌種：Saccharomlyces cerevisiae FFC2146，由大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏所提供。培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）。實(shí)驗(yàn)所用試劑：Chaps，IAM，DTT，IPG兩性電解質(zhì)來(lái)自Sigma公司；ASB-14為CALBIOCHEM公司；過(guò)硫酸銨，尿素為優(yōu)級(jí)純；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 馴化培養(yǎng) 從保藏的斜面上接取Saccharomlyces cerevisiae FFC2146至20 mL培養(yǎng)基中好氧條件過(guò)夜培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)兩次活化制成種子液。按2%接種量接入YPD培養(yǎng)基，分別在28℃和37℃下160 r/min馴化培養(yǎng)，每隔24 h，取1 mL菌液稀釋測(cè)600 nm處的吸光值，至28℃和37℃兩溫度的吸光度值基本一致，即生長(zhǎng)速度基本相同為止。

1.2.2 釀酒酵母培養(yǎng) 馴化培養(yǎng)后的菌株在對(duì)數(shù)期按2%接種量接入100 mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為160 r/min，28℃和37℃。做出釀酒酵母正常生長(zhǎng)溫度28℃和對(duì)照溫度37℃時(shí)的生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 酵母細(xì)胞掃描電鏡觀察 活化單菌落，接種1 mL種子液培養(yǎng)至穩(wěn)定期，分別于28℃和37℃下以160 r/min進(jìn)行24 h的振蕩培養(yǎng)后10 000×g 離心10 min收集細(xì)胞。離心后的菌體用超純水洗滌兩次，再次離心得酵母菌體，烘干、制片后用掃描電鏡觀察。

1.2.4 胞壁結(jié)合蛋白的提取 采用DTT抽提結(jié)合苯酚萃取法［8］。取28℃第15代與37℃第15代20 h發(fā)酵液于4℃，10 000×g離心，收集細(xì)胞沉淀。用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液清洗3次。用含有DTT，PMSF的上述緩沖液于冰浴中振蕩2 h后離心收集上清。上清液中加入等體積的Tris-平衡酚（pH8.0）冰浴振蕩萃取1 h后離心收集酚相與中間層。該液體加入3倍體積的預(yù)冷的乙酸銨/甲醇溶液，于-20℃冰箱中靜置過(guò)夜。第2天離心后，用含有DTT的丙酮清洗2次，再用冷丙酮清洗1次，凍干得到蛋白干粉。

1.2.5 雙向電泳技術(shù) 雙向電泳的操作在季楊楊［9］的方法上進(jìn)行了改進(jìn)。分裝蛋白：將得到的蛋白干粉用適量的蛋白裂解液（8 mol/L尿素、3 mol/L硫脲、50 mmol/L DTT、2% ASB-14、4% IPG buffer pH 3-10）溶解，用Bradford［10］方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，每管100 μg分裝。

雙向電泳：將0.64 g尿素、560 μL雙蒸水、250 μL 30%丙烯酰胺溶液混勻超聲除氣3 min，加入24 μL IPG buffer pH4-6、12 μL IPG buffer pH3-10混勻超聲除氣3 min，再加入4 μL10%過(guò)硫酸銨溶液、5 μL TEMED溶液，用1 mL槍反復(fù)吸打混勻，緩慢注入膠管中，室溫聚合45 min后使用。陰極緩沖液為30 mmol/L NaOH溶液，陽(yáng)極緩沖液采用10 mmol/L H3PO4溶液，陰極上樣，以300 V 35 min，700 V 1 h，1 600 V 4 h進(jìn)行第一向等電聚焦。

等電聚焦結(jié)束后，將膠條擠出進(jìn)行兩次膠條平衡，每次15 min。平衡液1（擠出平衡液加0.4%DTT 200 μL），平衡液2（基礎(chǔ)平衡液加1%碘乙酰胺500 μL）。平衡結(jié)束后，進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳，將平衡好的膠條放置在提前制好的15%的分離膠上，在轉(zhuǎn)移膠條的過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。電泳條件為20 mA 20 min，50 mA電流至電泳結(jié)束。二維電泳結(jié)束后，將凝膠固定過(guò)夜，次日用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，直至凝膠上蛋白點(diǎn)清晰可見(jiàn)。染色后的凝膠用掃描儀照相，利用PDquest8.0軟件對(duì)蛋白點(diǎn)進(jìn)行差異性分析。

1.2.6 質(zhì)譜分析

1.2.6.1 前期酶解 用去尖的槍頭從膠上切下蛋白點(diǎn)后清洗，加入50%乙腈/0.2 mol NH4HCO3（pH8.0）進(jìn)行脫色，用100%ACN進(jìn)行脫水，凍干后的膠加入胰蛋白酶溶液進(jìn)行酶解。

1.2.6.2 質(zhì)譜樣品制備 向吸漲后的膠塊加入不含胰蛋白酶的50 mmol NH4HCO3緩沖液，放置在37℃培養(yǎng)箱反應(yīng)過(guò)夜。離心后，取出上清轉(zhuǎn)移至加入了60%CH3CN/5 %TFA的新管中；在沉淀中加入超純水，孵化10 min，離心移出上清與前一管上清液混合；再向沉淀中加入60% ACN/0.1%TFA超聲15 min，吸出溶液并入前次上清，反復(fù)抽提2次，將所得上清用真空離心濃縮儀干燥5 min，放入-80℃冰箱中過(guò)夜。次日凍干后-80℃保存。

1.2.6.3 質(zhì)譜分析 利用Q Exactive質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。色譜條件：富集柱：C18（100 μm×2 cm），分析柱C18（75 μm×15 cm，2 μm），流動(dòng)相a：98%H2O+ 2%CH3CN+0.1%TFA， 流 動(dòng) 相b：20%H2O+80% CH3CN+0.1%TFA，柱溫35℃，流速0.25 μL/min。質(zhì)譜條件：噴霧電壓2.5 kV，離子源溫度300℃，掃描范圍：m/z=300-2 000。然后利用Xcalibue軟件和NCBI等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)，再利用KEGG將鑒定出的蛋白進(jìn)行代謝流分析。

2 結(jié)果

2.1 馴化結(jié)果

傳統(tǒng)釀酒酵母的最適溫度在 28-33℃，一般不超過(guò) 36℃，40℃以上將嚴(yán)重抑制菌體生長(zhǎng)［1］。首先對(duì)Saccharomlyces cerevisiae FFC2146進(jìn)行了耐溫馴化。由圖1可知，Saccharomlyces cerevisiae FFC2146在37℃馴化前期其生長(zhǎng)速度明顯低于28℃的，但隨著馴化時(shí)間的延長(zhǎng)（第15代），兩個(gè)培養(yǎng)溫度下菌體生長(zhǎng)速度基本一致。將馴化的菌株作為種子液，分別在28℃和37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，兩者均在20 h達(dá)到最大生長(zhǎng)量，且菌體濃度相近（圖2）；掃描電鏡分析表明，經(jīng)過(guò)馴化培養(yǎng)的釀酒酵母菌株在28℃與37℃下外觀形態(tài)無(wú)明顯變化，細(xì)胞完整（圖3），說(shuō)明Saccharomlyces cerevisiae FFC2146經(jīng)馴化后細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)依然保持良好的狀態(tài)。

圖1 釀酒酵母FFC2146耐熱馴化結(jié)果

圖2 釀酒酵母FFC2146生長(zhǎng)曲線

圖3 28℃（A）和37℃（B）FFC2146釀酒酵母的掃描電子顯微鏡圖

2.2 雙向電泳圖譜結(jié)果

圖4為在28℃與37℃培養(yǎng)溫度下釀酒酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜。利用PDquest軟件進(jìn)行檢測(cè)，分別檢測(cè)到539個(gè)蛋白斑點(diǎn)和540個(gè)蛋白點(diǎn)，兩者胞壁蛋白質(zhì)大多聚集在pH4-6的區(qū)域，分子量分布在30-90 kD之間。由于細(xì)胞壁蛋白的糖基化造成分子量不均，因此在圖譜上可見(jiàn)較為清晰的橫向拖尾，但圖譜的重復(fù)率（97.1%）比較好，靈敏度比較高，不影響圖譜的進(jìn)一步分析。當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)，生物體合成一系列響應(yīng)蛋白，以適應(yīng)環(huán)境變化，釀酒酵母在37℃培養(yǎng)時(shí)，新增2個(gè)（No.6、7）；消失1個(gè)（No.1）；上調(diào)2個(gè)（No.2、3）；下調(diào)2個(gè)（No.4、5），可見(jiàn)在不同溫度下胞壁蛋白的數(shù)量和表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。

圖4 正常生長(zhǎng)溫度28℃（A）與高溫37℃（B）條件下的釀酒酵母FFC2146胞壁蛋白雙向電泳圖

2.3 質(zhì)譜結(jié)果

根據(jù)上述雙向電泳圖譜分析的結(jié)果，選取1-7號(hào)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如表1所示。

3 討論

3.1 熱休克蛋白Ssa2保護(hù)細(xì)胞壁

大多數(shù)生物體在受到高溫刺激時(shí)，首先會(huì)合成進(jìn)化上高度保守的熱休克蛋白（Heat shock proteins），關(guān)閉某些正常的代謝途徑保護(hù)自身的同時(shí)開(kāi)啟另一代謝途徑，以保護(hù)細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)細(xì)胞受到脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白HSP70與熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子（Heat shock factor 1，HSF1）分離，HSF1迅速識(shí)別并結(jié)合至熱激元件（Heat shock element，HSE，5'-NGAAN-3'）［11］啟動(dòng)分子伴侶的轉(zhuǎn)錄，分子伴侶結(jié)合至未折疊的蛋白質(zhì)，阻止折疊錯(cuò)誤的發(fā)生。HSP70等熱休克蛋白結(jié)合至鋅指轉(zhuǎn)錄因子（MSN2/MSN4），MSN2/MSN4調(diào)控多個(gè)代謝脅迫應(yīng)答有關(guān)的基因，防止細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)受到高溫影響時(shí)產(chǎn)生沉淀，減少由蛋白酶體和溶酶體造成的不穩(wěn)定蛋白的水解降解［12］，從而使環(huán)境的不利影響降到最低限度［13］。然而熱脅迫首先會(huì)影響細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明Saccharomlyces cerevisiae FFC2146受到熱脅迫后胞壁中出現(xiàn)了Ssa2蛋白。Ssa2屬于熱休克蛋白70家族，在正常生長(zhǎng)環(huán)境中，調(diào)控基因Ssa2的表達(dá)處于休眠水平，Saccharomlyces cerevisiae FFC2146細(xì)胞壁中起到“管家”功能［14］。Saccharomlyces cerevisiae FFC2146新增的Ssa2蛋白不僅幫助保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激力的不利影響［15］，還參與真菌細(xì)胞壁的生物合成和蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，使酵母細(xì)胞在高溫下保持完整細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

3.2 無(wú)機(jī)焦磷酸酶調(diào)節(jié)糖酵解途徑流向

在釀酒酵母中，無(wú)機(jī)焦磷酸酶（Inorganic pyrophosphatase，PPase，EC3.6.1.1） 由 基 因IPP1的編碼，該酶在控制生物體內(nèi)無(wú)機(jī)焦磷酸濃度過(guò)程中起重要的作用。它催化一分子的焦磷酸脂轉(zhuǎn)化成兩分子正磷酸鹽離子［16］。圖4、表1可見(jiàn)Saccharomlyces cerevisiae FFC2146受到熱脅迫后細(xì)胞壁中的無(wú)機(jī)焦磷酸酶活性顯著提高，研究表明無(wú)機(jī)焦磷酸酶在催化焦磷酸水解的同時(shí)能夠提高細(xì)胞耐受非生物脅迫的能力［17］。焦磷酸水解是一個(gè)高放能的反應(yīng)，因此該反應(yīng)可以偶聯(lián)到一些不利于生物轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，推動(dòng)熱力學(xué)平衡向生物合成方向進(jìn)行［18］。無(wú)機(jī)焦磷酸酶參與氧化磷酸化反應(yīng)，可以控制體內(nèi)ATP的生成，從而調(diào)節(jié)糖酵解途徑流向［19］。

釀酒酵母的碳代謝途徑主要為糖酵解（EMP）（88%）途徑和戊糖磷酸（HMP）（12%）途徑（圖5），與之相關(guān)的酶系分布在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞壁上，其代謝調(diào)節(jié)比較復(fù)雜。研究表明與糖酵解有關(guān)的果糖-1，6-二磷酸激酶（Fructose-1，6-bisphosphatase），蘋(píng)果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase）、異檸檬酸裂解酶（Isocitrate lyase）、磷酸烯醇式丙酮酸烯醇酶（PhosphoenolpyruvateCarboxykinase）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase）、親環(huán)蛋白（Cyclophilin）等酶在細(xì)胞壁中發(fā)揮作用［20］。EMP途徑中有三個(gè)不可逆反應(yīng)步驟，分別由己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）參與。EMP途徑中三個(gè)關(guān)鍵酶之一的丙酮酸激酶是EMP途徑最后一個(gè)關(guān)鍵步驟，即磷酸烯醇式丙酮酸的磷?；鶊F(tuán)在PK的作用下，轉(zhuǎn)移到ADP上形成ATP，相應(yīng)地磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸。蛋白質(zhì)解析結(jié)果可見(jiàn)高溫脅迫下Saccharomlyces cerevisiae FFC2146的丙酮酸激酶表達(dá)關(guān)閉，說(shuō)明EMP途徑受阻，其上游的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶等酶的表達(dá)量亦下調(diào)。導(dǎo)致能量生成鏈的中間產(chǎn)物5-磷酸核酮糖和1，3-二磷酸甘油酸等合成減少。3-磷酸甘油醛脫氫酶已被鑒定為細(xì)胞壁的組成性蛋白［21］，1，3-二磷酸甘油酸合成受阻，導(dǎo)致糖酵解途徑中第一次底物水平磷酸化反應(yīng)被破壞。受高溫脅迫的Saccharomlyces cerevisiae FFC2146胞內(nèi)EMP途徑受到抑制后，在無(wú)機(jī)焦磷酸酶的調(diào)節(jié)作用下糖酵解流向發(fā)生改變，即EMP途徑的產(chǎn)物3-磷酸甘油醛進(jìn)入HMP途徑（圖5），轉(zhuǎn)酮醇酶（Transketolase，TK）是關(guān)聯(lián)HMP途徑和EMP途徑的紐帶，戊糖和己糖途徑的紐帶［22］。TK 主要催化三磷酸甘油醛和六磷酸果糖反應(yīng)產(chǎn)生五磷酸木糖和四磷酸赤癬糖，促進(jìn)3-磷酸甘油醛和七磷酸景天庚酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)槲辶姿崮咎呛退牧姿岢喟_糖［21］?？梢?jiàn)，釀酒酵母受到外界非生物脅迫后通過(guò)改變糖代謝流向，獲取新陳代謝提供足夠的能量，維持生命。

表1 S. cerevisiae特異性變化的蛋白

3.3 Small GTPase GSP1P的耐熱機(jī)制

Small GTPase GSP1P是屬于鳥(niǎo)苷三磷酸酶超家族的一類(lèi)單分子蛋白質(zhì)，它是一種溫度敏感蛋白［23］。它可以通過(guò)活性與非活性狀態(tài)控制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的開(kāi)關(guān)，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)處于運(yùn)輸狀態(tài)。Small GTPase Gsp1p主要與核過(guò)程有關(guān)，高溫脅迫后出現(xiàn)在酵母細(xì)胞壁，可能作為應(yīng)急反應(yīng)參與細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)輸送。

圖5 釀酒酵母的糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑

4 結(jié)論

高溫脅迫的Saccharomlyces cerevisiae FFC2146細(xì)胞壁蛋白質(zhì)中新增Ssa2和小分子鳥(niǎo)苷三磷酸酶，無(wú)機(jī)焦磷酸酶上調(diào)表達(dá)，而丙酮酸激酶缺消失，同時(shí)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶下調(diào)表達(dá)。說(shuō)明熱休克蛋白Ssa2保護(hù)細(xì)胞壁在高溫下保持完整，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖；高溫脅迫下釀酒酵母的EMP糖酵解途徑受阻，在轉(zhuǎn)酮醇酶的作用下糖酵解途徑轉(zhuǎn)向HMP途徑，獲取足夠的能量，維持細(xì)胞正常的新陳代謝。

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（責(zé)任編輯李楠）

A Protein Differential Analysis of Cell Wall in Saccharomyces cerevisiae Under Different Temperatures

Gu Yue1Piao Yongzhe1，2Du Wei1Wang Xiaoyu1Wang Chunyan1
（1. College of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034；2 . College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600）

Living organisms undergo a series of stresses from abiotic environment， and these stresses will affect the changes of genetic transcription and the expression of protein for quick adaptation to the changing environment. Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry were used to investigate the effects of high-temperature stresses on the proteome of cell wall in Saccharomyces cerevisiae. The results showed that， in S. cerevisiae FFC2146 under high temperature， proteins of cell walls had new Ssa2 and small molecules guanosine triphosphatase，inorganic pyrophosphatase was up-regulated， pyruvate kinase was deficient or even disappeared， and the expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase was down-regulated. These results indicated that the heat shock protein Ssa2 protected cell walls to be intact at a high temperature， therefore the cells grew and reproduced continuously；EMP glycolytic pathway of S. cerevisiae under heat stress was blocked， glycolytic pathway turned HMP pathway by transketolase， enough energy was obtained to maintain normal metabolism of cell.

Saccharomyces cerevisiae；two-dimensional electrophoresis；heat shock protein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.029

2015-04-10

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（DC13010204）

谷月，女，碩士，研究方向：釀酒酵母蛋白質(zhì)組學(xué)；E-mail：tingyue_678@126.com

樸永哲，男，博士，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：piaoyz@dlnu.edu.cn