赫玉芳趙昱瑋方向明呂 娜南敏倫* 焦連慶

（1 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長春 130012；2 長春理工大學(xué)，吉林 長春 130022；3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118）

葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷對照品的制備

赫玉芳1趙昱瑋1方向明2呂 娜3南敏倫1* 焦連慶1

（1 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長春 130012；2 長春理工大學(xué)，吉林 長春 130022；3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118）

目的 制備一種用于金蓮花及金蓮花制劑含量測定的對照品。方法 通過柱層析、重結(jié)晶方法進行分離、純化制備葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷對照品，采用薄層色譜法、HPLC歸一化法測定其純度；利用理化性質(zhì)、波譜特征鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果 從金蓮花的乙醇提取液中分離得到純度>98%的葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷。結(jié)論 葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷可以作為金蓮花及金蓮花制劑含量測定用對照品。

金蓮花；葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷；對照品；制備

金蓮花為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花（Trollius chinensis Bunge.）的花，為常用中藥，具有清熱解毒的作用，主要用于咽炎，扁桃體炎，急性中耳炎、急性淋巴管炎的治療[1]。金蓮花主要含有碳苷黃酮類化合物，以葒草苷和葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷為主，也是主要的抗菌消炎成分[2-3]。目前金蓮花藥材制成的單味制劑較多，包括片劑、膠囊、顆粒、口服液，但是，金蓮花藥材及制劑的質(zhì)量主要以蘆丁為對照品，測定總黃酮的含量[4]，缺乏有效的特征成分定量的質(zhì)量控制手段。本文首次對主要化學(xué)成分葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷進行對照品研究，為了進一步控制金蓮花藥材及制劑的質(zhì)量具有直接意義。

本實驗采用大孔樹脂分離得到總黃酮，利用葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的性質(zhì)，利用聚酰胺樹脂吸附極性小的黃酮，未吸附部分主要為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，與以往分離黃酮類化合物具有明顯不同，也為以后分離黃酮苷類化合物提供參考。本實驗主要采用常壓ODS反相硅膠柱純化葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，可以大量制備，具有快速、簡便、純化效果好的特點，具有工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用價值，也為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷分離純化提供一種新思路。

1　儀器與材料

LC-10A高效液相色譜儀（日本島津）；BRUKER AV-400型核磁共振波譜儀Finnigan LCQTM離子阱質(zhì)譜儀；BS 120S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。M-X-4顯微熔點測定儀（克勒格瓦尼分析儀器有限公司）；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；AB-8大孔吸附樹脂（天津波鴻樹脂科技有限公司）；聚酰胺吸附樹脂（天津津立龍精細化工有限公司）；ODS（北京京京時代科技發(fā)展有限公司）；硅膠G高效薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈（美國Fisher）；其他實際均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

金蓮花為內(nèi)蒙古阿爾山所產(chǎn)，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院趙全成教授鑒定為毛茛科植物金蓮花（Trollius chinensis Bunge.）的花。

2　試驗方法與結(jié)果

2.1提取分離與分離：取金蓮花藥材4 kg，加8倍量55%乙醇提取3次，每次2 h，合并提取液，濾過，回收乙醇，濃縮至浸膏，得乙醇提取浸膏0.85 kg。取乙醇提取浸膏，加去離子水至8000 mL，置AB-8大孔吸附樹脂（內(nèi)經(jīng)10 cm×柱高80 cm）上，先用去離子水洗脫至無色，再用55%乙醇洗脫4倍柱體積（約5000 mL×4），收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，減壓干燥，得金蓮花總黃酮268 g。

將金蓮花總黃酮用3000 mL去離子水溶解，置聚酰胺吸附樹脂柱（內(nèi)經(jīng)10 cm×柱高80 cm）上，用去離子水洗脫3倍柱體積，收集流出液及水洗脫液，濃縮，干燥，得到葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷粗品126 g。

取葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷粗品500 mg，用甲醇溶解，置常壓ODS柱（內(nèi)經(jīng)4 cm ×柱高60 cm），以乙腈-體積分數(shù)為0.35%磷酸溶液（15∶85）為洗脫劑，共得到62個流份，合并23～40流份，用1 mol/L碳酸鈉溶液調(diào)調(diào)pH為6，減壓蒸除乙腈后，利用乙酸乙酯振搖提取3次，每次250 mL，合并乙酸乙酯液，加入適量無水硫酸鈉，攪拌，放置，濾過，濾液回收溶劑，重結(jié)晶，得到葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷285 mg。

2.2理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒定：此化合物為黃色針狀結(jié)晶（甲醇），mp 218～220 ℃，鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，可溶于DMSO、甲醇等溶劑。ESI-MS m/z：608.9[M-H]-。1H-NMR，13C-NMR見表1，數(shù)據(jù)與文獻文獻[5]報道葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的數(shù)據(jù)基本一致，可確定化合物為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷（2"-O-β-L-galactopyranosylorientin）。結(jié)構(gòu)式見圖1。

表1　葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷在DMSO-d6的1H和13C-NMR數(shù)據(jù)

圖1　葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷結(jié)構(gòu)式

2.3純度檢測

2.3.1薄層色譜法：取葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷適量，加甲醇制成1 mg/mL的溶液。吸取上述溶液各5、10、15 μL點于同一硅膠G高效薄層板上，分別用：①乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶0.3）；②氯仿-甲醇-甲酸（8∶2∶0.5）；③乙酸乙酯-甲酸-水（10∶0.5∶0.5）三個展開系統(tǒng)展開，取出，展開劑揮干后，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點清晰，可見葒草素-2"-O-β-L-半乳糖苷相同顏色的斑點，色譜中不顯雜質(zhì)斑點。

2.3.2高效液相色譜法：取葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成0.2 mg/mL的溶液。液相色譜條件：ACE C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動相：乙腈-體積分數(shù)為0.4%磷酸溶液（15:85）[2]，檢測波長：340 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：室溫，進樣量：10 μL，采集時間為30 min，面積歸一法計算葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷質(zhì)量分數(shù)為99.35%。

2.4穩(wěn)定性：將葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷對照品于室溫條件下放置18個月，進行長期穩(wěn)定性考察。按“2.3.2”方法進行檢測，測定其峰面積值，面積歸一化法計算其質(zhì)量分數(shù)，實驗結(jié)果表明，葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷對照品在室溫條件下18個月內(nèi)穩(wěn)定。實驗結(jié)果見表2。

表2　葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷對照品穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3　討 論

金蓮花中葒草苷及葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷含量均在2.0%左右，有些產(chǎn)地含量可以達到3.5%，是主要的特征和有效成分[2]，但是，葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷沒有法定的對照品。本實驗采用大孔樹脂分離得到總黃酮，利用葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的性質(zhì)，以聚酰胺樹脂吸附極性小的黃酮，未吸附部分主要為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，與以往分離黃酮類化合物具有明顯不同，也為以后分離黃酮苷類化合物提供參考。

本實驗主要采用常壓ODS反相硅膠柱純化葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，可以大量制備，具有快速、簡便、純化效果好的特點，具有工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用價值，也為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷分離純化提供一種新思路。同時，本實驗制備葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷對照品符合中藥化學(xué)對照品的要求，可作為金蓮花藥材和含金蓮花成藥質(zhì)量控制，以及中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究用的化學(xué)對照品。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典(上冊)[M].上海:上海人民出版社, 1977:1398-1399.

[2] 赫玉芳,南敏倫,趙昱瑋,等. RP-HPLC 法同時測定金蓮花中3種碳苷黃酮的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2013,30(3):197-200.

[3] 王凌云,周艷輝,李藥蘭,等.長瓣金蓮花中黃酮苷的抑菌活性研究及牡荊苷的含量測定[J].中藥新藥與臨床藥理,2003,14(4):252-253.

[4] 譚曉紅,方秀梅.金蓮花中總黃酮含量的測定[J].張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2002,19(6):37-38.

[5] 董永喜,張桂青,王愛民,等.金蓮花水溶性化學(xué)成分的研究[J].中國藥業(yè),2012,21(19):17-18.

R282.710.3

B

1671-8194（2015）32-0032-02

吉林省科技發(fā)展計劃重點項目（20100909）

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