戚曉琳　韓繼召　董嫻寧　趙鵬▲

1.青島大學醫(yī)學院，山東青島266071；2.山東省青島市公安局刑警支隊法醫(yī)科，山東青島266034；3.青島大學附屬醫(yī)院病理科，山東青島266061

S100A4和P53蛋白在肥厚型心肌病心肌纖維化中的表達及意義

戚曉琳1韓繼召2董嫻寧3趙鵬3▲

1.青島大學醫(yī)學院，山東青島266071；2.山東省青島市公安局刑警支隊法醫(yī)科，山東青島266034；3.青島大學附屬醫(yī)院病理科，山東青島266061

目的研究肥厚型心肌?。℉CM）患者心肌細胞中S100A4、P53蛋白的表達，探討其與HCM心肌纖維化的關系。方法選擇2013年1月～2014年6月就診于北京阜外心血管醫(yī)院的HCM手術患者10例作為HCM組，10例青島地區(qū)交通事故及高墜致死者心肌組織為對照組。應用苦味酸天狼星紅染色法比較兩組的膠原容積分數(shù)；運用免疫組化法比較兩組心肌組織內S100A4、P53陽性表達情況；運用原位雜交方法檢測S100A4、P53 mRNA表達情況。結果HCM組心肌間質膠原容積分數(shù)顯著高于對照組（P＜0.01）。HCM組心肌組織S100A4、P53的IOD值均高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。HCM組心肌組織S100A4、P53的原位雜交值均高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論S100A4、P53蛋白過度表達可能在HCM心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用，可能為HCM心肌纖維化的治療提供新的方向。

肥厚型心肌??；心肌纖維化；S100A4；P53

肥厚型心肌?。╤ypertrophic cardiomyopathy，HCM）是常見的遺傳性心肌病，是以心肌非對稱性肥厚、左心室充盈受限、心室腔變小、舒張期順應性下降為特征的心肌?。?-3］。HCM是青壯年心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）的首要病因［4］。HCM年死亡率約為1%，世界范圍內的發(fā)病率約為0.2%［5］。HCM心肌纖維化，尤其是瘢痕形成被認為是導致惡性心律失常的重要原因［6-7］。HCM患者發(fā)生猝死主要由惡性心律失常所致。因此對于HCM心肌纖維化的發(fā)生機制及其影響因素的研究已經(jīng)成為HCM的研究熱點。

S100A4是鈣離子結合蛋白家族成員之一，S100A4蛋白定位在細胞核中，有報道證實，S100A4參與心肌纖維化的發(fā)生，從而導致心肌膠原蛋白過度降解，引發(fā)心臟組織重構［8-9］。它還能調節(jié)DNA與P53結合并影響其功能［10］。然而S100A4在HCM心肌組織中的作用機制還不清楚。本研究主要探討S100A4在心肌纖維化中的作用及其與P53的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2013年1月～2014年6月就診于北京阜外心血管醫(yī)院的HCM手術患者10例作為HCM組，排除標準：患有嚴重感染、腫瘤、腎衰竭、自身免疫疾病、結締組織疾病和其他嚴重慢性病者［11］。10例交通事故及高墜致死者心肌組織為對照組，納入標準：無心血管及嚴重慢性病病史，無心律失常、心肌肥厚及心臟結構性病變。本研究的實施嚴格遵照赫爾辛基宣言，已通過北京阜外醫(yī)院倫理委員會的審查。每例入組的參與者（及對照組家屬）均簽署書面知情同意書。

1.2主要儀器與試劑

Excelsior TM ES自動組織脫水機、Histocentre 3TM組織包埋機（德國Leica公司），SM2000R石蠟切片機（德國Leica公司），DP-BSW軟件（日本奧林巴斯公司），電熱恒溫水浴箱（北京醫(yī)療器械廠），Image-Pro Plus 6.0彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

一抗兔抗人S100A4、一抗兔抗人P53、山羊抗兔二抗、DAB顯色劑、PBS磷酸鹽緩沖液、抗體稀釋液、Tris/EDTA修復液（pH 9.0）（北京中杉金橋生物技術有限公司），天狼星紅染色試劑盒（上海榕柏生物技術有限公司），mRNA原位雜交探針（武漢Stargene實驗技術研發(fā)中心），Cyclin B1 mRNA原位雜交試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。S100A4靶基因的mRNA序列為：5′-GATGAGCAACTTGGACAGCAA-3′；5′-CTGGGCTGCTTATCTGGGAAG-3′。P53靶基因的mRNA序列為：5′-ACGACGGTGACACGCTTCCCTG-3′；5′-CGCTAGGATCTGACTGCGGCTC-3′。

1.3固定、取材及切片

常規(guī)取材入組心肌組織進行脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片5張，厚度為4 μm，用于進行苦味酸天狼星紅染色、免疫組化染色和mRNA原位雜交。

1.4苦味酸天狼星紅染色法檢測心肌纖維化程度

苦味酸天狼星紅染色方法［12］：常溫下（25℃）滴加苦味酸混合液、天狼星紅（天狼星紅1 g，飽和苦味酸100 mL，蒸餾水100 mL配制而成）適量，15～20 min后用95%乙醇洗片至無色，晾干切片，用中性樹膠進行封片。

心肌間質膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）計算：每張切片隨機選取5個視野（200×）進行拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分別對5個圖像進行分析，計算心肌間質CVF后取均值［13］。CVF=膠原面積/全視野面積。

1.5 S100A4、P53免疫組化染色

采用PV-6000免疫組化染色方法分別對兩組進行S100A4、P53免疫組化染色。一抗S100A4、P53稀釋度為1∶150，PBS代替一抗作為陰性對照。

心肌細胞S100A4、P53陽性表達呈棕黃色顆粒。每張切片按等距抽樣原則隨機選取5個不重復視野（400×）進行拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分別對圖像進行分析，分別測出其平均光密度、面積，計算心肌細胞內S100A4、P53陽性表達的積分光密度［14］（integral optical density，IOD）后取均值。IOD=平均光密度×面積。

1.6原位雜交檢測心肌S100A4、P53 mRNA表達

原位雜交檢測心肌S100A4、P53 mRNA表達，每片組織滴加20 μL雜交液［包含1 ng/μL cRNA探針，200 μg/mL葡萄糖，4×鹽水枸櫞酸鈉（SSC）］，然后放入含50%甲酰胺濕盒中雜交16～20 h，于2×SSC洗3次，用1∶100馬血清封閉后，用Avidin+Biotin-HRP孵育，最后用NBT/BCTP（450 μg/mL∶175 μg/mL）顯色30 min后終止并用明膠封片。

原位雜交結果以結構清晰且著色顯著高于背景，在細胞核或胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒的為陽性，不著色或顯色強度與背景無明顯差別者為陰性細胞［15］。每張切片隨機選取5個高倍視野（400×），統(tǒng)計其陽性細胞數(shù)量和著色程度，取均值。采用原位雜交值法進行陽性結果統(tǒng)計［16］。A表示陽性細胞數(shù)分級：0%～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B表示陽性細胞顯色強度分級：0（陰性）、1（弱陽性）、2（陽性）、3（強陽性），原位雜交值=A×B。

1.7統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1兩組心肌組織天狼星紅染色結果

HCM組心肌組織CVF為0.218±0.087，較對照組的0.098±0.031高，差異有高度統(tǒng)計學意義（t＝4.10，P＜0.01）。

HCM組：心肌細胞呈現(xiàn)紫紅色，多數(shù)細胞的橫切面積明顯肥大，心肌間質可見大量膠原纖維組織增生（圖1A）。對照組：心肌細胞呈紅色，細胞橫切面積未見明顯異常，心肌間質可見少量紅色膠原纖維（圖1B）。2.2兩組心肌組織S100A4、P53免疫組化染色結果

圖1　兩組心肌組織天狼星紅染色結果（200×）

HCM組心肌組織S100A4、P53的IOD值均高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1　兩組心肌組織S100A4、P53的IOD值比較（x±s）

HCM組心肌細胞內S100A4、P53陽性顆粒表達顯著增多，對照組心肌細胞內S100A4、P53呈少量表達。見圖2。

2.3兩組心肌組織S100A4、P53原位雜交結果

HCM組心肌組織S100A4、P53的原位雜交值均高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

HCM組心肌細胞內S100A4、P53 mRNA陽性表達顯著增多，對照組心肌細胞內S100A4、P53 mRNA呈少量表達。見圖3。

圖2　兩組心肌組織S100A4、P53免疫組化染色結果（200×）

表2　兩組心肌組織S100A4、P53原位雜交值比較（x±s）

圖3　兩組心肌組織S100A4、P53原位雜交結果（200×）

3　討論

心肌纖維化是HCM患者典型的病理學改變，也是一系列臨床表現(xiàn)的病理基礎，在一定程度上心肌纖維化的程度決定患者的預后［17］。本研究應用苦味酸天狼星紅染色法比較兩組的CVF，研究發(fā)現(xiàn)，HCM組膠原含量明顯高于對照組，提示心肌組織膠原重構時在體內的膠原合成增強。S100A4蛋白是鈣結合蛋白家族成員之一，有研究表明，S100A4蛋白參與心肌纖維化的發(fā)生，促進其心肌膠原蛋白過度降解，進而導致心臟組織重構加重［10，18］。

P53蛋白是S100A4的靶蛋白之一，與S100A4蛋白共同定位在細胞核內并相互作用，主要誘導細胞凋亡和促進分化［19］。在滑膜組織成纖維細胞上，S100A4可能與P53相互作用從而導致成纖維細胞的異常增殖［20］。有實驗顯示，在心肌肥大的大鼠心肌纖維化過程中，S100A4能通過調節(jié)P53相關基因，使S100A4蛋白與野生型P53蛋白發(fā)生整合，使野生型P53蛋白作用于成纖維細胞，促進其異常增殖，膠原合成增加，并在細胞外間質不斷沉積，最終表現(xiàn)為間質纖維化［20］。

免疫組化法檢測HCM患者心肌組織中S100A4、P53的蛋白表達，運用原位雜交法結果表明，HCM心肌組織中的S100A4、P53蛋白表達陽性率顯著高于對照組，提示S100A4、P53的相互作用可能導致某些細胞因子作用于成纖維細胞，促使其遷移、過度增殖，進而導致膠原合成增加。目前已有研究支持心肌纖維化是HCM的原發(fā)改變而非繼發(fā)于心肌肥厚之后的病理改變［21］。

S100A4、P53的相互作用與HCM心肌纖維化的關系尚未見國內外文獻報道，本研究盡管在mRNA水平和蛋白水平顯示HCM組S100A4、P53表達以及膠原含量變化較對照組明顯增高，但S100A4、P53在HCM心肌纖維化過程中的詳盡作用有待進一步研究。

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Expression and significance of S100A4 and P53 in myocardial fibrosis of hypertrophic cardiomyopathy

QI Xiaolin1HAN Jizhao2DONG Xianning3ZHAO Peng3▲
1.Medical College of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao266071，China；2.Department of Forensic Medicine，Public Security Bureau Criminal Police Detachment of Qingdao City，Shandong Province，Qingdao 266034，China；3.Department of Pathology，Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao266061，China

Objective To investigate the expression of S100A4 and P53 of cardiomyocytes in patients with hypertrophic cardiomyopathy（HCM）and their correlation with myocardial fibrosis of HCM.Methods 10 cases of patients with HCM operation in Beijing Fuwai Cardiovascular Hospital from January 2013 to June 2014 were selected as HCM group.10 cases of myocardial tissues of traffic accidents and high fall to the death in Qingdao area were selected as control group.Collagen volume fraction between two groups was compared by using picrosirius red staining method.Positive expression of S100A4 and P53 in myocardial tissue between two groups were compared by using immunohistochemical method.Expression of S100A4 mRNA and P53 mRNA were detected by using in situ hybridization method.Results Collagen volume fraction of myocardial interstitial in HCM group was significantly higher than that in control group（P＜0.01）.IOD of S100A4，P53 in HCM group were significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.In situ hybridization value of S100A4，P53 in HCM group were significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Conclusion Overexpression of S100A4 and P53 may play an important role in the process of myocardial fibrosis in HCM，may provide a new direction for the treatment of myocardial fibrosis in HCM.

Hypertrophic cardiomyopathy；Myocardial fibrosis；S100A4；P53

R542.2

A

1673-7210（2015）12（b）-0044-04

2015-09-23本文編輯：李亞聰）

山東省青島市產(chǎn)學研合作引導計劃（應用基礎研究）（13-1-4-141-jch）。

戚曉琳（1989.10-），女，青島大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)病理學專業(yè)2013級在讀碩士研究生；研究方向：肥厚型心肌病與心源性猝死。