北京北大維信生物科技有限公司（100094）王曉峰 孫玉鳳 鄧翀

我廠現(xiàn)紅曲生產(chǎn)工藝的批量由3500kg變更至4000kg，原紅曲取樣驗證方案適用于紅曲生產(chǎn)工藝批量為3500kg，其所得結論“在生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)容器改變、工藝控制參數(shù)改變或批量改變需要進行再驗證”。現(xiàn)通過再驗證，確認按照取樣操作規(guī)程所取紅曲批量為4000kg的紅曲樣品的洛伐他汀含量，能夠正確反映整批的待出料紅曲有效成分含量。評價取樣方法的有效性、代表性和科學性，為證明取樣方法的真實有效性提供基本依據(jù)。

紅曲取樣方法、取樣量按《中國藥典》（2010年版）第一部執(zhí)行。經(jīng)過風險評估，認為：取樣量根據(jù)《藥典》規(guī)定公式計算隨批量擴大，不存在風險；紅曲為分房間、分車、分瓶貯存，取樣方法采用對角線交叉取樣的方法，此方法已經(jīng)過3500kg的取樣驗證，取樣量擴大后，首先計算好取樣瓶數(shù)，再根據(jù)房間的布局合理選擇每車每列的取樣瓶數(shù)，可以保證取樣的代表性，不存在風險；原用于取樣時樣品混合的槽型混合機（設備型號CH100）不能滿足現(xiàn)有樣品混合量而采用新的取樣用槽型混合機（設備型號CH200），因而存在槽型混合機不能充分混合均勻紅曲的風險，和從槽型混合機中取出的紅曲樣品不能夠正確反映整批的待出料紅曲有效成分（洛伐他汀）含量的風險。

因此，風險評估得出的驗證項目為：應確認所取紅曲樣品，在取樣用槽型混合機中可以充分混合均勻，從槽型混合機中取出的紅曲樣品能夠正確反映整批的待出料紅曲有效成分（洛伐他汀）含量。通過分析驗證過程中樣品混合均一度測定數(shù)據(jù)（洛伐他汀含量相對標準偏差），最終驗證我廠紅曲取樣方法在取樣量擴大后，取樣用槽型混合機能保證樣品的混合均一度，能保證樣品的代表性。

本驗證過程均按照我公司驗證管理規(guī)程執(zhí)行，以下就驗證實施過程、數(shù)據(jù)收集分析、驗證結論等方面逐一闡述。

1 驗證前準備

附圖1 紅曲取樣流程圖

1.1 人員 所有參加紅曲取樣方法再驗證的相關操作人員、驗證管理人員和QA生產(chǎn)監(jiān)控員，在驗證開始前應進行《紅曲取樣方法再驗證方案》的培訓，培訓記錄納入培訓檔案。

1.2 關鍵儀器、設備確認檢查 開始本次取樣驗證前，確認相關的儀器和設備確認已完成，且均符合要求，檢查結果記錄于《關鍵儀器、設備確認檢查記錄》。

關鍵設備槽型混合機（設備型號CH200，以下簡稱“槽型混合機”）容量200L，攪拌式混合方式，攪拌槳直徑540mm，電機功率4KW，倒料角度105°，攪拌轉速24r/min，重量550kg，出廠日期2003年12月，由江蘇瑰寶集團有限公司生產(chǎn)，設備情況良好，運行正常，未進行大修，已經(jīng)過容量核算和現(xiàn)場試驗證明能滿足4000kg紅曲濕料樣品的混合。

2 驗證實施

2.1 取樣批次和取樣量

2.1.1 取樣量 因紅曲批量由3500kg變更為4000kg，按照《紅曲取樣SOP》（根據(jù)《藥典》制定）進行最大量取樣，取樣量規(guī)定為：100＜瓶數(shù)N≤1000時，按5%取樣；瓶數(shù)N＞1000瓶時，前1000瓶按照上述方法確定取樣瓶數(shù)，超過部分按1%取樣，取樣瓶數(shù)計算若所得數(shù)值不是整數(shù)值，一律取比計算值大的第一個整數(shù)為準。（引自參考文獻[1]）而4000kg紅曲最大可能瓶數(shù)為20133.3瓶。因此，總取樣瓶數(shù)=50+（N-1000）×0.01=50+（20133.3-1000）×0.01=50+191.3=241.3（瓶）

向上取一位整數(shù)值，取樣242瓶。

2.1.2 取樣批次 選取紅曲連續(xù)三批4000kg批量的紅曲濕料，批號為H1、H2、H3。檢測合格后，每批取242瓶，用蒸汽滅菌器（1.0m3）進行滅活處理用于驗證。

2.2 取樣方法 取樣流程見附圖1。

2.2.1 整批紅曲的取樣 采用對角線法按隨機取樣原則取樣，直至取夠規(guī)定樣品瓶數(shù)。取出的紅曲從發(fā)酵瓶轉入槽型混合機混合。

2.2.2 槽型混合機內的取樣 取樣部位的選定參照《藥品GMP指南》口服固體制劑關于混合設備混合均一度取樣的規(guī)定：“至少應在上、中、下三個水平位置進行多點取樣”。（引自參考文獻[2]）

取樣部位：CH200型槽型混合機的攪拌槳是半葉式對稱型，以軸為中心進行旋轉攪拌，其與中心軸不同水平面的倉內四角（中心軸平面上層2角，下層2角）及雙葉的對稱中心點為易聚積物料處、混合效果最差，為取樣點。

附圖2 H3批洛伐他汀含量數(shù)據(jù)方差分析

2.3 取樣 運行槽型混合機（速度24轉/分鐘），分別在混合的第1、2、3、4分鐘進行取樣。對倉內4角和中心點分別取樣約60g，由QA生產(chǎn)監(jiān)控員用取樣勺在槽型混合機中心軸的中心點處取樣，然后放入取樣袋中記為取樣點3；用取樣勺緊貼料斗倉內四角，然后將物料取出，將取樣勺中的樣品放到取樣袋中，分別記為取樣點1、2、4、5；每個位點樣品取3份（1份檢驗，2份備份），備份樣品存放在QC理化冰箱內。QC檢驗人員按照紅曲質量標準，用高效液相色譜法檢測樣品中的洛伐他汀的含量，將結果記錄。

2.4 驗證標準 槽型混合機每分鐘混合后5個取樣點之間液相含量相對標準偏差RSD應≤5.0%，最終以三批均能滿足上述條件的混合時間為槽型混合機的樣品混合時間。

3 數(shù)據(jù)收集與分析

3.1 三批次驗證數(shù)據(jù)見附表1。

3.2 數(shù)據(jù)分析 H1批、H2批通過數(shù)據(jù)表明槽型混合機的混合3分鐘能保證混合均勻；H3批數(shù)據(jù)超過預定標準，為偏差。

3.3 偏差分析

3.3.1 H3批洛伐他汀含量數(shù)據(jù)見附表2。

3.3.2 方差分析 使用JMP（版本10）對數(shù)據(jù)進行方差分析，α水平0.05，使用完全析因模型（模型效應：取樣點，取樣次數(shù)（以混合時間區(qū)分），取樣點*取樣次數(shù)（以混合時間區(qū)分），（方法出自參考文獻[3]）。結果及解釋如下（見附圖2）。

從分析可見，取樣點、取樣次數(shù)、取樣點與取樣次數(shù)交互作用的效應產(chǎn)生的變異對于誤差項并不顯著，因此，本次試驗數(shù)據(jù)的變化可認為由其他誤差項引起。

3.3.3 誤差項分析 取樣方法驗證過程中，導致數(shù)據(jù)變異的因素，應為：樣品均勻度、檢驗精密度，而《紅曲取樣方法再驗證方案》中規(guī)定的“5個取樣點之間液相含量相對偏差RSD應≤5.0%”，僅考慮了混合不均勻造成的變異。

檢驗精密度為1個樣品6次檢驗相對偏差RSD應≤3.0%，結論來自《LC-20A高效液相色譜儀再確認報告》。所以，應同時考慮混合不均勻造成的變異和檢驗精密度造成的變異。

3.4 偏差處理

3.4.1 偏差處理原理 根據(jù)中心極限定理，從正態(tài)分布的總體取若干樣品，亦呈正態(tài)分布；以樣本標準偏差代替總體分布的標準偏差，以樣本均值、樣本標準差形成新的統(tǒng)計量t服從t分布。

利用t分布的覆蓋因子k表（t分布的雙側分位數(shù)表），以樣本量n的大小不同情況下對樣本平均值的預測區(qū)間進行估計。本案例中取樣是從被混合的產(chǎn)品這一正態(tài)總體中進行抽取的，洛伐他汀含量檢驗是對同一樣品多次檢驗且在《LC-20A高效液相色譜儀再確認報告》確認檢驗結果的正態(tài)性的，因此，樣本均值的預測區(qū)間均可以使用t分布進行估計（方法自參考文獻[4]）：

附表1 槽型混合機內5個取樣點之間洛伐他汀含量相對標準偏差（RSD）

附表2 H3批洛伐他汀含量數(shù)據(jù)

附表3 液相含量相對偏差RSD標準的修改

x為樣品檢測值；X為樣品平均值；σ為樣本相對標準偏差；k為n個樣品的t分布的覆蓋因子（90%置信度）

《藥典》2010年版附錄X E含量均勻度檢查法使用90%置信度估計含量均勻的置信區(qū)間，因此使用90%置信度。（引自參考文獻[1]）

若樣品均勻度造成的變異數(shù)據(jù)的t分布為RSD1，檢驗精密度造成的變異數(shù)據(jù)的t分布為RSD2，根據(jù)方差性質，此2總體合成的總體中樣本的相對標準偏差σ為：

3.4.2 處理過程 紅曲取樣方法再驗證混合均一度樣品的液相含量相對偏差RSD標準的修改如附表3所列。

《藥品GMP指南》口服固體制劑規(guī)定：“混合均一度應該控制在85%～115%或更嚴格的工藝指標，相對標準偏差不應高于7.8%” （引自參考文獻[2]），因此x∈ [85%X，115%X]。由(4-1)，即X*（1±2.13σ）∈ [85%X，115%X]，計算得σ≤7.04%，可見σ同時滿足《藥品GMP指南》“相對標準偏差不應高于7.8%”的規(guī)定。

故在驗證混合均一度時，應同時考慮混合不均勻造成的變異、檢驗精密度造成的變異，并宜根據(jù)“混合均一度應該控制在85%～115%或更嚴格的工藝指標，相對標準偏差不應高于7.8%”的規(guī)定制定驗證數(shù)據(jù)總體的相對標準偏差的標準。本次驗證以不增加相對標準偏差的原則進行調整為：±7.0%，即相對標準偏差標準定為RSD≤7.0%。

3.4.3 偏差處理結論 偏差經(jīng)分析并做調整樣品相對標準偏差標準的處理后，偏差可接受。根據(jù)RSD≤7.0%的標準，H1、H2、 H3數(shù)據(jù)表明槽型混合機（設備型號CH200）混合2分鐘均能保證混合均勻。為保證混合時間余量，取混合時間為3分鐘。

4 結論

通過對紅曲取樣方法進行再驗證，驗證結果無遺漏，已對偏差進行合理說明；不需要進一步補充試驗。驗證實施過程中對驗證方案有1處修改：“槽型混合機每分鐘混合后5個取樣點之間液相含量相對標準偏差RSD應≤5.0%”，改為“槽型混合機每分鐘混合后5個取樣點之間液相含量相對標準偏差RSD應≤7.0%”。最終證實：驗證結果真實有效，取樣時可以使用槽型混合機（設備型號CH200）混合，混合速度24轉/分鐘，混合時間3分鐘；紅曲（4000kg）的取樣方法取得的樣品，能夠代表整批紅曲的真實含量。

根據(jù)驗證結果，將《紅曲取樣操作程序》變更如下：由“槽型混合機（設備型號CH100，設備編碼XXXX）混合3分鐘”變更為“槽型混合機（設備型號CH200，設備編碼XXXX）混合3分鐘”。操作程序變更后，對QA取樣人員進行培訓，以保證驗證結論的執(zhí)行。