徐志偉，常曉彤

持續(xù)果糖飲水誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗機(jī)制

徐志偉，常曉彤

（河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院生化教研室，河北張家口075000）

目的探討果糖誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗機(jī)制。方法小鼠隨機(jī)分為3組，分別為單純飲水的正常對(duì)照組，10%果糖飲水組，10%果糖+精氨酸飲水組。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為4周，期間，分析血清促胰島素肽（GIP）和胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）水平；4周后，測(cè)定各組小鼠空腹血糖和胰島素水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)；分析各組小鼠肝臟活性氧簇（ROS）水平。結(jié)果10%果糖飲水導(dǎo)致小鼠發(fā)生胰島素抵抗，果糖干預(yù)不影響小鼠血清GIP和GLP-1水平，但肝臟組織ROS水平升高（P＜0.05）；10%果糖+精氨酸飲水組胰島素抵抗指數(shù)沒(méi)有顯著變化，血清GLP-1水平升高，肝臟組織ROS水平?jīng)]有顯著變化。結(jié)論10%果糖飲水使小鼠肝臟組織ROS水平升高，而血清GLP-1水平不升高，無(wú)法發(fā)揮GLP-1對(duì)肝臟的保護(hù)作用，最終升高的ROS引起小鼠胰島素抵抗。

果糖；小鼠；胰島素抵抗；ROS；腸激素

自從上世紀(jì)50年代以來(lái)，一系列研究表明果糖能夠在實(shí)驗(yàn)大鼠誘導(dǎo)胰島素抵抗，單獨(dú)果糖攝入或在飼料中添加果糖一直被應(yīng)用于胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備。研究顯示，果糖的攝入也可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)大鼠代謝綜合征的所有特征，及氧應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂、脂肪肝、微量清蛋白尿和腎?。?］。幾個(gè)臨床研究觀察了高果糖飲食與胰島素抵抗的關(guān)系，F(xiàn)AEH等發(fā)現(xiàn)健康男性每日3 g/kg果糖的補(bǔ)充可以顯著導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗［2］，AEBERLI在健康男性青年的研究也得到同樣的結(jié)果，果糖攝入使肝臟葡萄糖合成增加［3］。隨著果糖，特別是高果糖的玉米糖漿在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，食物果糖攝入的增加被認(rèn)為與人類肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征及高血壓人數(shù)的增加相關(guān)［4］。

腸道是機(jī)體最大的激素分泌器官，碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)在腸道的出現(xiàn)能夠促進(jìn)許多腸激素的分泌。研究證實(shí)，腸激素不僅調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng)、分泌和吸收，也通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)諸多生理活動(dòng)。腸激素中胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide，GLP-1）、葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽（glucosedependent insulinotropic peptide，GIP）是廣為熟知的兩種腸激素，它們能夠刺激胰島素分泌。研究表明，GLP-1在肝臟也阻止氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥因子對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用［5］。GLP-1和GIP可以阻止細(xì)胞因子、糖毒性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、過(guò)氧化氫、鏈尿佐菌素對(duì)β細(xì)胞的毒性作用，及嚴(yán)重肥胖引起的細(xì)胞凋亡［6］。該事實(shí)提示，伴隨食物消化吸收分泌的GIP和GLP-1對(duì)機(jī)體組織也具有保護(hù)作用，可以阻止過(guò)量攝食對(duì)機(jī)體組織的損害。作為營(yíng)養(yǎng)成分之一，果糖攝取引起的胰島素抵抗是否與腸激素GIP和GLP-1相關(guān)未見報(bào)道，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠持續(xù)給予果糖飲水喂養(yǎng)，觀察小鼠胰島素抵抗、血清GIP和GLP-1水平變化及組織活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）濃度，以探討果糖誘導(dǎo)胰島素抵抗的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康4周齡雄性昆明小鼠，體重（20±2）g，由首都醫(yī)科大學(xué)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京2014-00 04）。

1.2主要試劑與藥物

葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司，胰島素ELISA測(cè)定試劑盒、GIP、GLP-1 ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ROS化學(xué)熒光法測(cè)試盒、蛋白定量考馬斯亮藍(lán)法測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)處理

適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組，每組20只，分別為不添加果糖的單純飲水喂養(yǎng)小鼠組（正常對(duì)照組）；10%果糖飲水處理小鼠組；10%果糖+精氨酸（Arg，每100 ml添加精氨酸鹽酸鹽10 g）飲水喂養(yǎng)小鼠組；各實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)4周，期間自由飲水，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。期間進(jìn)行小鼠血清GIP、GLP-1水平分析。4周后，去除干預(yù)24 h，進(jìn)行各項(xiàng)其他指標(biāo)分析。

1.4觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.4.1血液收集及空腹血糖和血清胰島素的測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組小鼠空腹8 h后，斷尾法采集小鼠尾血，離心（1 088×g/min，5 min）制備血清，用于血糖測(cè)定或置入-80℃冰箱冷凍保存用于胰島素測(cè)定。血糖測(cè)定用葡萄糖氧化酶法試劑盒，20μl血清加3 ml酶酚混合試劑，37℃保溫15 min，以722分光光度計(jì)在505 nm測(cè)定吸光度，按公式計(jì)算血糖濃度；胰島素測(cè)定采用小鼠胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒，首先進(jìn)行空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔加樣50μl，37℃溫育30 min，洗滌拍干后，加入酶標(biāo)液50μl，空白孔除外，37℃溫育30 min，洗滌拍干。每孔加入顯色劑A、B各50μl，37℃避光顯色10 min，每孔加終止液50μl，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度。

1.4.2胰島素抵抗采用Turner的穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)法（HOMA-IR）［7］胰島素抵抗指數(shù)=［空腹血糖（mmol/L）×空腹血清胰島素（mIU/L）］/22.5。

1.4.3肝臟組織ROS的測(cè)定小鼠處死，立即完整取出肝臟組織，分別稱重，按1∶20（重量∶體積）的比例加入勻漿介質(zhì)（100 mmol/L磷酸緩沖液），冰水浴條件下機(jī)械勻漿，1 000 g離心10 min，取上清液。部分上清液用考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒測(cè)量蛋白含量，0.05 ml樣品加3 ml考馬斯亮藍(lán)顯色液，靜置10 min，以722分光光度儀在595 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)含量；部分上清液用活性氧測(cè)定試劑盒（DCFH-DA法）測(cè)定活性氧簇?zé)晒鈴?qiáng)度，即在190μl勻漿上清液加入1 mmol/LDCFH-DA工作液（即熒光探針）10μl，對(duì)照孔加入10μl PBS，充分混勻，37℃孵育30 min，在熒光分光光度計(jì)以535 nm波長(zhǎng)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。結(jié)果以熒光強(qiáng)度/毫克蛋白表示。

1.4.4血清GIP和GLP-1測(cè)定在實(shí)驗(yàn)第2周，采集各組小鼠血液，制備血清，置入-80℃冰箱冷凍保存，GIP和GLP-1分析采用GIP和GLP-1 ELISA試劑盒，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔加樣50μl，37℃溫育30 min，洗滌拍干后，加入酶標(biāo)液50μl，空白孔除外，37℃溫育30 min，洗滌拍干。每孔加入顯色劑A、B各50μl，37℃避光顯色10 min，每孔加終止液50μl，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠空腹血糖和血清胰島素濃度

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，分析各組小鼠空腹血糖，3組小鼠未發(fā)現(xiàn)血糖異常，均在正常范圍，各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；果糖飲水組小鼠胰島素水平顯著增加，為（37.26±4.25）mIU/L，與正常對(duì)照小鼠（18.64± 3.62）mIU/L比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；果糖+Arg飲水組小鼠胰島素水平低于果糖飲水組小鼠（P＜0.05），雖然高于正常對(duì)照組，但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見附表。

附表　各組小鼠空腹血糖和胰島素水平（n=18，±s）

附表　各組小鼠空腹血糖和胰島素水平（n=18，±s）

注：?與正常對(duì)照組比較，P＜0.05

組別空腹血糖/（mmol/L）血清胰島素/（mIU/L）正常對(duì)照組5.46±0.5118.64±3.62果糖組6.13±0.4237.26±4.25?果糖+精氨酸組5.82±0.4725.23±3.85

2.2各組小鼠胰島素抵抗指數(shù)分析

以穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)法（HOMA-IR）進(jìn)行的胰島素抵抗指數(shù)分析表明，果糖飲水組小鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著升高，為（10.15±2.13），與正常對(duì)照小鼠（4.52± 0.75）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；果糖+Arg飲水組小鼠胰島素抵抗指數(shù)（6.53±1.86）低于果糖飲水組小鼠（P＜0.05），雖然高于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1　各組小鼠胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR

2.3小鼠血清GIP和GLP-1水平

實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)各組小鼠進(jìn)行的分析表明，果糖飲水?dāng)z入并沒(méi)有增加小鼠血清GIP和GLP-1水平，分別為（3.18±0.34）和（36.43±5.54）pmol/L，正常對(duì)照小鼠分別為（3.06±0.43）和（35.03±6.68）pmol/L，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是果糖+Arg組小鼠血清GLP-1水平（54.21±6.25）pmol/L增加，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），GIP無(wú)顯著增加，與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2　各組小鼠血清GIP和GLP-1水平

2.4小鼠肝臟組織ROS水平

果糖飲水組小鼠肝臟組織ROS水平（0.83± 0.07）cd/mg pro顯著升高，與正常對(duì)照組（0.46± 0.08）cd/mg pro比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），果糖+Arg組小鼠肝組織ROS（0.57±0.06）cd/mg pro稍高于正常組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3　化學(xué)發(fā)光法測(cè)定的各組小鼠胰肝臟ROS水平

3 討論

與已有的研究一樣，本研究使用10%的果糖飲水也誘導(dǎo)小鼠的胰島素抵抗，HOMA-IR分析顯示，小鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著高于正常對(duì)照小鼠。但是在果糖飲水中同時(shí)添加精氨酸則顯著改善小鼠的胰島素抵抗，抵抗指數(shù)雖然稍高于正常小鼠，但與正常對(duì)照小鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究的上述結(jié)果或許與腸道分泌的激素相關(guān)。營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)入體內(nèi)首先經(jīng)腸道的消化吸收，并刺激腸激素的分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng)、分泌、吸收及諸多生理活動(dòng)和保護(hù)作用。GLP-1和GIP是腸激素中最重要的兩種。雖然2014年KUHRE的研究指出果糖能夠刺激小鼠、大鼠及人的GLP-1分泌，不刺激GIP的分泌［8］，但本研究中飲水中果糖的緩慢攝入并沒(méi)有引起小鼠血清GLP-1和GIP的增加，原因不清。但是，果糖同時(shí)添加精氨酸則導(dǎo)致小鼠血清GLP-1的顯著增加。作為蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，體外研究顯示谷氨酰胺、苯丙氨酸、色氨酸等可以刺激GLP-1和GIP的分泌［9］，MACE的研究表明［10］，在各種促GLP-1和GIP分泌的氨基酸中，作用強(qiáng)度分別為苯丙氨酸＞精氨酸＞谷氨酰胺～色氨酸＞天冬酰胺。由于苯丙氨酸溶解度低，本研究應(yīng)用精氨酸添加到果糖飲水中，結(jié)果顯示精氨酸的加入明顯增加了小鼠血清GLP-1水平。

為說(shuō)明血清GLP-1增加是如何改善小鼠胰島素抵抗的，筆者分析肝臟組織的活性氧簇（ROS）水平。肝臟是胰島素受體最密集的臟器之一，對(duì)胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取極為敏感［11］。ROS被認(rèn)為是胰島素抵抗產(chǎn)生的原因，已有研究表明，ROS對(duì)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中的胰島素受體、胰島素受體底物、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均有負(fù)面影響［12］。HOEHN的研究顯示［13］，線粒體超氧化物的產(chǎn)生引起許多培養(yǎng)組織的胰島素抵抗，呼吸鏈抑制劑、解偶聯(lián)劑、超氧化物歧化酶可以逆轉(zhuǎn)胰島素受體抵抗。

本研究顯示，果糖攝入組小鼠肝臟ROS顯著增加，而果糖添加精氨酸組小鼠肝臟ROS雖然高于正常對(duì)照，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中，果糖引起的肝臟ROS增加與果糖在肝內(nèi)產(chǎn)生的尿酸相關(guān)，果糖在果糖激酶催化下形成1-磷酸果糖，該過(guò)程迅速且不受反饋抑制，消耗ATP產(chǎn)生的AMP大量轉(zhuǎn)化為尿酸，并且果糖也刺激氨基酸如甘氨酸生成尿酸，尿酸在包括肝臟組織在內(nèi)的許多組織細(xì)胞可以引起線粒體氧應(yīng)激［14］。果糖添加精氨酸組小鼠肝臟ROS沒(méi)有出現(xiàn)明顯的升高，或許與精氨酸促進(jìn)的血清GLP-1水平增加相關(guān)，F(xiàn)ONTANA指出［5］，GLP-1在肝臟可以阻止氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥因子對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用。其他研究表明［15-17］，GLP-1或其類似物可以降低大鼠肝臟氧化應(yīng)激水平，改善胰島素抵抗。因此，在果糖添加精氨酸組小鼠胰島素抵抗的顯著改善是由于血清高水平的GLP-1在肝臟組織阻止果糖產(chǎn)生的ROS毒性作用。

總之，果糖引起的小鼠胰島素抵抗是由于果糖誘導(dǎo)肝臟組織ROS水平增加，但不能同時(shí)刺激腸道GLP-1和GIP的分泌，無(wú)法阻止肝臟ROS的毒性作用，即果糖逃避GLP-1對(duì)肝臟的保護(hù)作用，通過(guò)產(chǎn)生的ROS引起胰島素抵抗。

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（張蕾編輯）

Mechanism of insulin resistance in mice induced by continuous fructose solution drinking

Zhi-wei XU，Xiao-tong CHANG
（Department of Biochemistry，North University of Hebei，Zhangjiakou，Hebei 075000，P.R.China）

【Objective】To explore the mechanism of insulin resistance in mice induced by fructose solution drinking.【Methods】Mice were randomly assigned into 3 groups including normal control group，10% fructose group and 10%fructose+arginine group.All the groups were treated for 4 weeks.Serum glucagonlike peptide-1（GLP-1）and glucose-dependent insulin-releasing polypeptide（GIP）levels were analyzed during the treatment.After 4 weeks，fasting blood glucose and serum insulin levels were determined，index of insulin resistance was calculated by HOMA-IR，and liver reactive oxygen species（ROS）level was measured.【Results】Drink of 10%fructose induced insulin resistance，significantly elevated the index of insulin resistance and liver ROS level compared to the control group（P＜0.05）；whereas the levels of serum GLP-1 and GIP were not significantly different from those of the control group.However，in 10%fructose+arginine group，the index of insulin resistance was not significantly different from that of the control group although it was higher，serum GLP-1 elevated significantly compared with that of the control group（P＜0.05），the liver ROS level was not significantly different from that of the control group.【Conclusions】Drinking 10%fructose may result in increased ROS level in liver tissue without elevating serum GLP-1 level；so the toxic effect of ROS can not be prevented by GLP-1，leading to insulin resistance in mice.

fructose；mouse；insulin resistance；ROS；gut hormone

R363.14；R-332

A

1005-8982（2015）36-0007-05

2015-07-03

常曉彤，Tel：18931316309；E-mail：changxt1212@vip.sina.com