陳曉飛 孫玉飛 馮菲 王雪妍 周伏忠

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司 河南省微生物工程重點試驗室，鄭州 450008）

鷹嘴豆蛋白降解產(chǎn)物的抗氧化作用

陳曉飛 孫玉飛 馮菲 王雪妍 周伏忠

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司 河南省微生物工程重點試驗室，鄭州 450008）

旨在分析鷹嘴豆分離蛋白（CPI）及其不同分子量短肽的抗氧化活性。用堿性蛋白酶（Alcalase）處理CPI，得到其降解產(chǎn)物，該降解產(chǎn)物經(jīng)超濾離心，得到分子量分別為＜3 kD、3-5 kD、5-10 kD及＞10 kD的短肽。結(jié)果表明，與其它大分子肽段相比，＜3 kD的短肽具有較強的自由基清除活性；與谷胱甘肽（GSH）相比，CPI及其不同分子量短肽具有顯著的金屬離子螯合活性；CPI及其肽段具有一定的三價鐵離子還原能力。上述結(jié)果表明，CPI及其肽段的顯著抗氧化活性，使得其具有制備抗氧化功能食品和保健品的應(yīng)用前景。

鷹嘴豆分離蛋白（CPI）；短肽；谷胱甘肽（GSH）；自由基；抗氧化作用

活性氧和自由基是人體新陳代謝過程的次生代謝產(chǎn)物，正常情況下總是處于不斷產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡中，但如果因產(chǎn)生過多或清除過少，致使其含量過高，動態(tài)平衡被破壞，就會引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而引發(fā)癌癥、冠心病、動脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)失靈、免疫力降低、關(guān)節(jié)炎等100多種常見疾?。?］。有研究表明，一些生物活性物質(zhì)具有清除活性氧和自由基的抗氧化功能，這與其它生理功能，如免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降膽固醇、抗腫瘤等都有一定的聯(lián)系，可能是其它生理功能的基礎(chǔ)［2］。目前有報道指出，通過補充抗氧化物質(zhì)，如食用抗氧化功能食品或保健食品，防止活性氧和自由基對細(xì)胞和組織的損傷，是預(yù)防多種疾病的有效措施之一［3］，而食用功能性抗氧化食品是一種既方便又有效的補充抗氧化劑的方法。因此，開發(fā)具有抗氧化功能的食品和保健食品對預(yù)防和治療多種慢性疾病具有重要意義。

鷹嘴豆（Chickpea）學(xué)名Cicer arietinum L.，一年生或越年生草本植物，因其籽粒形狀酷似鷹嘴而得名，又名雞頭豆、腦黑豆等，是野豌豆族鷹嘴豆屬植物中的一個栽培品種，是世界第二大消費豆類，中國新疆是鷹嘴豆的主要產(chǎn)地之一［4，5］。鷹嘴豆富含人類所需的多種糖類、植物蛋白和氨基酸、纖維素、維生素及無機鹽，具有預(yù)防高血壓及動脈粥樣硬化、降低膽固醇和血脂血糖，利尿、治療失眠等作用［6-9］。李艷紅等［10］的研究表明，用蛋白酶處理鷹嘴豆分離蛋白，在水解度為15%時，其酶解產(chǎn)物（鷹嘴豆短肽），具有顯著的抗氧化功能，但他們并沒有將短肽按照分子量不同分開，而有研究表明［11，12］，經(jīng)堿性蛋白酶降解后，可能因為不同分子量短肽的某些氨基酸含量不同，導(dǎo)致其抗氧化活性不同。因此，本研究將鷹嘴豆分離蛋白用蛋白酶水解后，測定不同分子量短肽的抗氧化功能，以期為鷹嘴豆短肽的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鷹嘴豆為市售商品；堿性蛋白酶（Alcalase）購自南寧龐博生物工程公司；DPPH、菲洛嗪和鄰二氮為Sigma產(chǎn)品；谷胱甘肽購自Solarbio公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

鷹嘴豆分離蛋白（Chickpea protein isolates，簡稱CPI）的制備參考陳曉飛等［13］的方法。

1.2.1 鷹嘴豆短肽的制備 鷹嘴豆短肽的制備參考Comfort［3］的方法，將CPI溶于蒸餾水中（2%，W/W），55℃預(yù)熱20 min，調(diào)pH8.5，加入堿性蛋白酶至［E］/［S］為4%，混勻后不斷滴加2 mol/L NaOH，以維持pH8.5不變，反應(yīng)持續(xù)4 h，沸水浴15 min，后用2 mol/L HCl調(diào)pH4.0，以確保徹底滅活蛋白酶，并凝結(jié)未被降解的蛋白。反應(yīng)液冷卻至室溫后，7 000×g離心30 min，上清液依次過截留分子量（MWCO）為3 kD、5 kD和10 kD的超濾離心管，即3 kD超濾管中的截留物通過5 kD的超濾管，截留物再通過10 kD的超濾管，從而分別獲得分子量為＜3 kD、3-5 kD、5-10 kD和＞10 kD的肽段。CPI和不同分子量肽段的蛋白濃度用Lowry法［14］測定，后將其用蒸餾水稀釋至1 mg/mL，置于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 CPI及其水解片段的DPPH自由基清除活性測定 參考Shimada［15］的方法略有修改，用96孔板測定CPI及其水解片段清除DPPH自由基的活性。具體方法為，100 μL樣品或谷胱甘肽（GSH）（1 mg/mL）+100 μL DPPH（0.1 mmol/L，溶于甲醇），混勻，室溫避光靜置30 min，測定517 nm處的吸光度，此為As（Asample）；Ac（Acontrol）為100 μL水+100 μL DPPH的吸光度；Ab（Ablank）為100 μL甲醇+100 μL樣品的吸光度，用1 mg/mL GSH代替樣品作為陽性對照（以下試驗均用GSH作陽性對照）。樣品對DPPH自由基清除率的計算公式為：DPPH自由基清除率（%）=［1（-As-Ab）/Ac］×100%。

1.2.3 CPI及其水解片段的羥基自由基（·OH）清除活性測定 采用1，10-鄰二氮菲比色法［16］測定CPI及其水解片段清除·OH的活性，鄰二氮雜菲（3 mmol/L）溶于0.1 mol/L pH7.4的磷酸鈉鹽緩沖液（PBS）中，F(xiàn)eSO4（3 mmol/L）和0.01%雙氧水（H2O2）溶于蒸餾水中，取50 μL的樣品或GSH，加入96孔板中，后加入50 μL鄰二氮雜菲，混勻，再加入50 μL的FeSO4混勻，最后加入50 μL H2O2，混勻加蓋，37℃保溫60 min，測定反應(yīng)液536 nm處的吸光度，此為樣品組（A1），并測定空白組（A2不含樣品和H2O2）和對照組（A0不含樣品）?！H清除能力的計算公式為：SR%=［（A1-A0）/（A2-A0）］×100%。

1.2.4 CPI及其水解片段的超氧陰離子（·O2-）清除活性測定 采用鄰苯三酚自氧化法［17］測定CPI及其水解片段的超氧陰離子清除活性，取80 μL 1 mg/mL樣品或GSH，與80 μL 50 mmol/L pH8.3的Tris-HCl緩沖液（含1 mmol/L EDTA）加入96孔板中，隨后加入40 μL鄰苯三酚（1.5 mmol/L，溶于10 mmol/L HCl中），室溫靜置30 min測定420 nm處的吸光度，此為樣品組（A1）；對照組（A0）中不含肽段或GSH，空白組（A2不含鄰苯三酚），·O2-清除能力的計算公式為：SR%=（A0- A1+A2）/ A0×100%。

1.2.5 CPI及其水解片段Fe3+還原能力測定 CPI及其水解片段Fe3+還原能力測定參考Wu［18］的方法略有修改，取250 μL樣品或GSH與250 μL 1%的鐵氰化鉀水溶液混勻（對照中不含樣品），50℃保溫20 min，隨后加入250 μL 10% TCA水溶液，混勻，5 000×g離心10 min，取100 μL上清液+與20 μL 0.1% FeCl3水溶液+80 μL蒸餾水混勻，室溫靜置10min，測定700 nm處吸光度。

1.2.6 CPI及其水解片段金屬離子螯合活性測定參考Comfort［3］的方法測定CPI及其水解片段的金屬離子螯合活性，1 850 μL樣品或GSH+50 μL 2 mmol/L FeCl2混勻，加入100 μL 5 mmol/L菲洛嗪溶液（溶于生理鹽水中），充分混勻，25℃靜置10 min，取200 μL于96孔板中，測其562 nm處的吸光度，此為樣品組（As），對照（Ac）中不含樣品，空白對照（Ab）中不含菲洛嗪，金屬離子螯合活性計算公式為：螯合活性（%）=［1-（As-Ab）/Ac］×100%。

2 結(jié)果

2.1 CPI及其水解片段的DPPH自由基清除活性

DPPH是一種脂溶性自由基，在517 nm處有最大吸收值，該自由基在遇到質(zhì)子供體如抗氧化物的時候會被清除，517 nm處的吸光度下降。CPI及其不同分子量肽段清除DPPH自由基的能力（圖1）顯示，與CPI及其肽段相比，GSH對DPPH自由基的清除能力最強（91%）。＜3 kD和3-5 kD兩種短肽之間，清除DPPH自由基的能力沒有顯著差異（P＞0.05），但均高于5-10 kD和＞10 kD的短肽，而CPI則幾乎沒有DPPH自由基清除活性。結(jié)果表明，小分子質(zhì)量短肽對DPPH自由基的清除能力較大分子質(zhì)量短肽強。

圖1 CPI及其水解片段的DPPH自由基清除活性

2.2 CPI及其水解片段的羥基自由基（·OH）清除活性

·OH是氧自由基中最活躍的分子，在金屬離子如銅離子和鐵離子存在的時候，可以產(chǎn)生超氧離子和過氧化氫，并且可以嚴(yán)重破壞幾乎所有可以接觸到的生物大分子，如蛋白質(zhì)、DNA、多不飽和脂肪酸、核酸等。CPI及其肽段清除·OH的能力（圖2）顯示，與GSH相比，CPI及其肽段清除·OH的能力要弱的多（P＜0.05）；而與＜3 kD、3-5 kD、5-10 kD短肽及CPI相比，＞10 kD的短肽具有最強的清除·OH的能力（20.08%）。

圖2 CPI及其水解片段的·OH清除活性

圖3 CPI及其水解片段的·O2-清除活性

2.4 CPI及其水解片段的Fe3+還原能力

物質(zhì)的還原能力，可以反映其潛在的抗氧化活性。本研究中，CPI及其水解片段的還原能力，通過將Fe3+還原為Fe2+，測700 nm處的吸光度來檢測。圖4顯示，GSH的還原能力是CPI及其肽段還原能力的6倍以上。而與其不同分子量肽段相比，CPI的還原能力要低得多（P＜0.05）。

圖4 CPI及其水解片段的Fe3+還原能力

2.5 CPI及其水解片段的金屬離子螯合活性

過度狀態(tài)的金屬離子，如Fe2+能夠催化活性氧的產(chǎn)生，進而引起脂肪的氧化反應(yīng)，還可以催化Haber-Weiss反應(yīng)，產(chǎn)生超氧離子和·OH，從而對組織產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞，因此，抗氧化物對金屬離子的螯合活性，可以抑制脂肪氧化。CPI及其水解片段對Fe2+的螯合能力（圖5）表明，GSH沒有金屬離子螯合活性，CPI及肽段螯合活性非常強，且不同肽段相比，分子量越大，F(xiàn)e2+螯合能力越強。

圖5 CPI及其水解片段的金屬離子螯合活性

3 討論

物質(zhì)清除DPPH自由基和還原Fe3+的活性，可以反映其潛在的抗氧化能力；而·OH能夠引起脂肪的氧化，并嚴(yán)重破壞相鄰的生物大分子，從而引起動脈粥樣硬化、早衰、癌癥等嚴(yán)重的疾病，而超氧陰離子自由基和過度狀態(tài)的金屬離子則可以加快脂肪的氧化反應(yīng)，并產(chǎn)生·OH自由基，因此，清除·OH和超氧陰離子自由基及螯合金屬離子在延遲脂肪氧化及預(yù)防疾病上非常重要，而且還可以減輕對依賴金屬離子的食物脂肪氧化的破壞影響，從而起到食物防腐的作用。

本試驗測定了CPI及其短肽的自由基清除、Fe3+還原及金屬離子螯合等抗氧化活性。結(jié)果表明，鷹嘴豆短肽具有較強的清除DPPH、·OH和超氧陰離子自由基的能力，且這種自由基清除能力可能與短肽的分子量大小有關(guān)，這與之前Li［19］的報道及Girgih［16］關(guān)于非洲豆薯籽粒蛋白降解產(chǎn)物清除自由基的報道相似；試驗結(jié)果還可以看出，CPI及其肽段具有較強的金屬離子螯合能力，目前還未見CPI及其肽段相關(guān)方面的報道，這可能有效抑制脂肪氧化反應(yīng)。因此，如果未來的研究證明這些短肽可以口服使用，將為人類預(yù)防血管中動脈粥樣硬化斑塊的形成提供一個新的有效途徑，并可能進一步發(fā)展為抗心腦血管疾病發(fā)展的藥物?？傊珻PI及肽段在清除自由基和螯合金屬離子上的作用表明，其具有發(fā)展為食源性抗氧化藥劑的潛力，并可作為抗氧化（防腐劑）的自然資源，為食品保鮮。

4 結(jié)論

堿性蛋白酶水解CPI后，降解產(chǎn)物通過超濾離心得到不同分子量鷹嘴豆短肽（＜3 kD、3-5 kD、5-10 kD及＞10 kD），CPI及其短肽的抗氧化活性測定。結(jié)果表明，與其它大分子肽段相比，＜3 kD的短肽具有較強的自由基清除活性（清除DPPH、·OH和超氧陰離子自由基的活性分別為43.6%、18.6%和55.7%）；CPI及其不同分子量短肽具有較強的金屬離子螯合活性（其中5-10 kD和＞10 kD短肽活性最高，可達到95%以上）和一定的Fe3+還原能力。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Antioxidant Properties of Chickpea Protein Hydrolyzed Fractions

Chen Xiaofei Sun Yufei Feng Fei Wang Xueyan Zhou Fuzhong
（Institute of Biology Co.，Ltd.，Henan Academy of Sciences，Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province，Zhengzhou 450008）

It was to assay the antioxidant activities of the Chickpea protein isolates（CPI）and its peptide fractions in vitro. CPI were hydrolyzed with alcalase， and the hydrolysates were further separated into peptide fractions of ＜3 kD， 3-5 kD， 5-10 kD and ＞10 kD， respectively，using membrane ultrafiltration. Results showed that， the ＜3 kD peptides exhibited better ferric reducing power and radicals scavenging activities when compared to peptide fractions of higher molecular weights. CPI and its peptide fractions had significant ability to chelate metal ions compared to glutathione（GSH）， and also had some ferric reducing powers. The remarkable antioxidant properties indicate that CPI and its peptide fractions have the potential to be used in manufacturing antioxidant functional foods and healthy foods.

chickpea protein isolates（CPI）；oligopeptide；glutathione（GSH）；radicals；antioxidant properties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.016

2014-08-11

河南省科技開放合作項目（142106000201），鄭州市科技攻關(guān)計劃項目（141PPTGG415）

陳曉飛，女，碩士研究生，助理研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)；E-mail：chenfaye0318@163.com

周伏忠，男，碩士，研究員，研究方向：微生物工程與應(yīng)用技術(shù)；E-mail：zdsyszfz001@163.com