張欣欣，王勇，楊慶斌

（安徽省合肥市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽合肥230001）

肺炎克雷伯菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶和qnr基因檢測(cè)及耐藥分析

張欣欣，王勇，楊慶斌

（安徽省合肥市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽合肥230001）

目的檢測(cè)痰標(biāo)本中肺炎克雷伯菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC酶）和qnr基因的存在情況及耐藥性，為臨床合理使用抗菌藥物提供參考。方法收集痰標(biāo)本中分離到的肺炎克雷伯菌114株，用瓊脂稀釋法檢測(cè)耐藥性，三維試驗(yàn)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測(cè)ESBLs酶、AmpC酶及qnr基因存在情況。結(jié)果114株肺炎克雷伯菌中，ESBLs陽(yáng)性58株（50.88%），產(chǎn)AmpC酶14株（12.28%），同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶10株（8.77%），qnr陽(yáng)性2株；產(chǎn)酶株對(duì)抗菌藥物的耐藥率顯著高于不產(chǎn)酶株。結(jié)論痰標(biāo)本中肺炎克雷伯菌耐藥基因的檢測(cè)率較高，多重耐藥明顯；碳青霉烯類具有較好的抗菌活性。

肺炎克雷伯菌；細(xì)菌耐藥；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；頭孢菌素酶

肺炎克雷伯菌為呼吸道感染重要致病菌，患者病死率較高［1］。近年來(lái)，隨著抗菌藥物應(yīng)用強(qiáng)度及程度的增加，肺炎克雷伯菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率呈不斷升高趨勢(shì)。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC酶）和qnr基因?yàn)榉窝卓死撞?dāng)前耐藥的重要原因。筆者收集了114株痰標(biāo)本中分離到的肺炎克雷伯菌，對(duì)其進(jìn)行ESBLs，AmpC酶和qnr耐藥基因檢測(cè)及耐藥性分析，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集來(lái)自安徽省多家醫(yī)院送檢的痰標(biāo)本中分離出的114株肺炎克雷伯菌，菌株鑒定均由Vitek全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)完成。

1.2 藥物敏感性試驗(yàn)

采用瓊脂稀釋法，操作和結(jié)果判讀按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）2012版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。其中選擇大腸埃希菌ATCC25922為不產(chǎn)酶株，陰溝腸桿菌029M為AmpC酶質(zhì)控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC700603為ESBLs質(zhì)控菌株，菌株均由安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心提供。氨芐西林（AMP，山東齊魯制藥有限公司），哌拉西林他唑巴坦（TZP，美國(guó)Wyeth-Ayerst公司），頭孢呋辛（CXM，上海新亞藥業(yè)有限公司），頭孢噻肟（CTX，安徽威爾曼制藥有限公司），頭孢曲松（CRO，臺(tái)灣泛生制藥廠股份有限公司），頭孢他啶（CAZ，葛蘭素史克公司），頭孢吡肟（FEP，中美上海施貴寶制藥有限公司），頭孢西?。‵OX，海口制藥廠有限公司），氨曲南（ATM，江西制藥有限責(zé)任公司），亞胺培南西司他丁（IMP，默沙東公司），美羅培南（MEM，日本住友制藥株式會(huì)社），慶大霉素（GEN，上海第一生化藥業(yè)有限公司），環(huán)丙沙星（CIP，廣州南新制藥有限公司），加替沙星（GAT，南京圣和藥業(yè)有限公司），左氧氟沙星（LVX，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司），阿米卡星（AMK，上海旭東海普藥業(yè)有限公司）。

1.3 Am pC酶及ESBLs檢測(cè)

酶粗提物制備：參考文獻(xiàn)［2］描述的方法培養(yǎng)細(xì)菌，獲得菌體沉淀，反復(fù)凍融提取細(xì)菌酶液，在4℃以10 000 r/min離心10min提取上清液。上清液經(jīng)MH瓊脂平板細(xì)菌培養(yǎng)陰性后置-20℃冰箱保存，備用。

AmpC酶和ESBLs檢測(cè)：參考文獻(xiàn)［2］提供的方法行AmpC酶和ESBLs的三維試驗(yàn)檢測(cè)。將受試菌液接種MH瓊脂平板上，取頭孢西丁紙片置平皿中心，余操作按步驟進(jìn)行。如觀察到狹槽與抑菌圈交接處出現(xiàn)擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)，視為AmpC酶三維試驗(yàn)陽(yáng)性。ESBLs檢測(cè)時(shí)用頭孢曲松取代頭孢西丁，余操作相同，如在狹槽與頭孢曲松交界處出現(xiàn)擴(kuò)大的細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)域，視為ESBLs陽(yáng)性。

1.4 細(xì)菌質(zhì)粒提取與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增

對(duì)其中10株同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的肺炎克雷伯菌行qnr基因PCR擴(kuò)增，直接煮沸法提取細(xì)菌質(zhì)粒。根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的qnr基因序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，引物由北京賽百盛公司合成。PCR反應(yīng)體系（50μL）包含：10×buffer 5μL，dNTPS mixture（2.5mmol/L）4μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），rTaq酶（5μ/L）0.25μL，質(zhì)粒模板4μL，上述試劑均購(gòu)自大連寶生物公司。引物序列P1：5′-TCAGCAAGAGGATTTCTCA3′，P2：5′-GGCAGCACTATTACTCCCA 3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃1min，退火溫度48℃40 s，72℃延伸1min共35次循環(huán)，再72℃延伸5min。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為627 bp，擴(kuò)增過(guò)程中以大腸埃希菌ATCC25922及空白為陰性對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)酶株為陽(yáng)性對(duì)照。選取PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行純化測(cè)序，測(cè)序儀器為ABIPRISM3730，測(cè)序試劑為BigDye terminator v 3.1，測(cè)序結(jié)果由GenBank blast程序行比對(duì)確定。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)ESBLs及Am pC酶檢測(cè)

在114株肺炎克雷伯菌標(biāo)本中，其中產(chǎn)ESBLs58株，陽(yáng)性率達(dá)50.88%；產(chǎn)AmpC酶14株，陽(yáng)性率達(dá)12.28%；同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶10株，陽(yáng)性率為8.77%。

2.2 PCR擴(kuò)增

10株肺炎克雷伯菌行PCR擴(kuò)增后，2株qnr檢測(cè)陽(yáng)性。將測(cè)序結(jié)果上網(wǎng)比對(duì)，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的qnr基因序列一致。

2.3 肺炎克雷伯菌耐藥試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表1。AmpC酶、ESBLs及同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs菌株對(duì)16種抗菌藥的耐藥率均高于陰性菌株，其中產(chǎn)ESBLs菌株僅對(duì)美羅培南、亞胺培南、哌拉西林他唑巴坦、頭孢他啶敏感，對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率均達(dá)50%以上；產(chǎn)AmpC酶菌株除對(duì)碳青霉烯類藥物敏感外，其他抗菌藥物耐藥率基本在60%以上，且產(chǎn)酶肺炎克雷伯菌株多重耐藥現(xiàn)象明顯。

表1 肺炎克雷伯菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率檢測(cè)結(jié)果［株（%）］

3 討論

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院獲得性肺炎常見(jiàn)致病菌，分離率一直呈增多趨勢(shì)［3］。隨著抗菌藥物的大量應(yīng)用，肺炎克雷伯菌對(duì)藥物的耐藥性也呈現(xiàn)不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)，耐藥株不斷增多，多重耐藥現(xiàn)象也明顯［4-5］，這其中最主要的原因是其能產(chǎn)生大量ESBLs和AmpC酶。β-內(nèi)酰胺酶主要通過(guò)水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，使β-內(nèi)酰胺類抗生素喪失活性。肺炎克雷伯菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的重要機(jī)制就是產(chǎn)生ESBLs，ESBLs通過(guò)水解青霉素、廣譜頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類藥物的β-內(nèi)酰胺酶，導(dǎo)致抗生素耐藥。本研究中檢測(cè)了114株痰標(biāo)本中肺炎克雷伯菌，其ESBLs陽(yáng)性率高，達(dá)50%左右，可能與本地區(qū)醫(yī)院抗生素使用強(qiáng)度和種類有關(guān)，易誘導(dǎo)ESBLs產(chǎn)生。產(chǎn)ESBLs株僅對(duì)碳青霉烯類、哌拉西林他唑巴坦及頭孢他啶較敏感，對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率均達(dá)50%以上，耐藥率較高。非產(chǎn)酶株對(duì)抗菌藥物的耐藥率幾乎均小于35%（除氨芐西林），產(chǎn)酶株對(duì)抗菌藥物的耐藥率明顯高于不產(chǎn)酶株。哌拉西林他唑巴坦較敏感，提示含有酶抑制劑的抗菌藥物可提高對(duì)產(chǎn)酶菌株的敏感性。頭霉素類抗菌藥物如頭孢西丁對(duì)產(chǎn)ESBLs細(xì)菌有較好的抗菌作用，但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，其耐藥性高，且頭霉素類易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生AmpC酶，故臨床不宜應(yīng)用。檢測(cè)提示頭孢他啶相對(duì)較敏感，可能與本地區(qū)頭孢他啶的使用率較低及基因表型有關(guān)。因ESBLs基因存在多種表型，對(duì)頭孢菌素的水解能力有差異。但因臨床治療效果不佳，故其使用仍需慎重。

目前對(duì)AmpC酶穩(wěn)定的藥物主要有碳青霉烯類和第4代頭孢菌素類（如頭孢吡肟）。本檢測(cè)結(jié)果顯示，AmpC酶株對(duì)包括頭孢吡肟在內(nèi)的抗菌藥物耐藥率基本在60%以上，可能與第4代頭孢使用強(qiáng)度高及這14株中的10株同時(shí)產(chǎn)ESBLs酶有關(guān)，導(dǎo)致其耐藥率較高，應(yīng)引起重視。但碳青霉烯類藥物仍具有較高的敏感度，故一旦發(fā)現(xiàn)AmpC酶陽(yáng)性株，應(yīng)首選。

肺炎克雷伯菌對(duì)抗菌藥物耐藥率高的主要原因是其能產(chǎn)生大量的ESBLs和AmpC酶，可通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)，導(dǎo)致耐藥菌的傳播［6-7］。肺炎克雷伯菌是多種耐藥質(zhì)粒主要的宿主之一，因整合子、轉(zhuǎn)座子等作用，1種質(zhì)?？赏瑫r(shí)攜帶多個(gè)耐藥基因，使得產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的肺炎克雷伯菌表現(xiàn)為多重耐藥。在114株肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)有10株同時(shí)產(chǎn)ESBLs酶和AmpC酶，陽(yáng)性率達(dá)8.77%，本檢測(cè)結(jié)果顯示，除亞胺培南及美羅培南敏感外，對(duì)其余抗菌藥物藥率均超過(guò)60%，多重耐藥比較嚴(yán)重。

細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要有藥物作用靶位的改變、膜通透性改變及主動(dòng)外排機(jī)制，這些機(jī)制由染色體介導(dǎo)，為主動(dòng)耐藥機(jī)制［8-9］。qnr基因編碼的蛋白可保護(hù)細(xì)菌免受喹諾酮類藥物的攻擊，從而增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性［10-11］。qnr蛋白僅引起對(duì)喹諾酮類藥物的較低水平耐藥，但由于其具有對(duì)其他耐藥突變的保護(hù)作用，使菌群能達(dá)到二次突變的濃度，從而使細(xì)菌發(fā)生更高程度的耐藥［12-13］。本研究中檢測(cè)出2株qnr陽(yáng)性，均同時(shí)產(chǎn)ESBLs及AmpC株，除美羅培南、亞胺培南外，其他14種抗菌藥均耐藥。雖然qnr基因檢測(cè)率較低，但由于qnr基因所在的質(zhì)粒常攜帶其他耐藥基因（如aac，bla等），可在同種或不同細(xì)菌之間傳播，引起細(xì)菌耐藥性的增加，故臨床危害大。

綜上所述，痰標(biāo)本中分離的肺炎克雷伯菌產(chǎn)生ESBLs及AmpC酶、qnr基因存在可能是其對(duì)抗菌藥物耐藥或多重耐藥的主要原因。產(chǎn)酶菌除碳青霉烯類敏感，對(duì)大多數(shù)抗菌藥物耐藥率高。我國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率為10%左右，雖然大多數(shù)菌株仍對(duì)其敏感，但美國(guó)2011年發(fā)生了碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌流行［14］，值得警惕。為防止肺炎克雷伯菌感染的發(fā)生和流行，只有合理應(yīng)用抗菌藥物，嚴(yán)格掌握用藥原則；同時(shí)及時(shí)準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及ESBLs與AmpC酶、qnr基因的檢測(cè)，才能為臨床合理應(yīng)用抗菌藥物提供依據(jù)，以防止耐藥菌產(chǎn)生。

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Analysis of Drug Resistance and Detection of ESBLs，Am pCβ-lactamases and qnr in K lebsiella Pneum onia

Zhang Xinxin，Wang Yong，Yang Qingbin
（Department of Respiratory Medicine，Hefei Second People′s Hospital，Hefei，Anhui，China 230001）

Objective To investigate the antibiotic resistance and detection of ESBLs，Ampcβ-lactamases and qnr in Klebsiella pneumonia isolated from the sputum，and to provide reference for clinical rational use of antibiotics.Methods A total of 114 strains of Klebsiella pneumonia were selected，Agar dilution test was used in susceptibility testing.The Genotes of ESBLs，AmpC and qnr was detected and analyzed by three-dimensional test and PCR.Results In the 114 strains of Klebsielinsla pneumonia，58 strains（50.88%）produced ESBLs and 14（12.28%）produced AmpCβ-lactamases，10（8.77%）produced both ESBLs and AmpCβ-lactamases，2 strains carried qnr；The rates of resistance to most antibiotics in drug resistant enzyme strain were higher than negative counterparts.Conclusion The Klebsiella Pneurnonia Producing drug-resistant gene isolated from the sputum are common，most of them are multiple drug resistant.Almost all strains were susceptible to Carbapenem.

Klebsiella pneumonia；resistance to Drug；qnr；ESBLs；Ampc

R969.3；R915

A

1006-4931（2015）22-0054-03

2015-05-13）