王世鋒何劍陳怡露鄭濤沈其榮雍曉雨

（1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京　211816；2. 南京工業(yè)大學 生物能源研究所，南京　211816；3.南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京　210095）

Bacillus amyloliquefaciens C1菌株γ-PGA合成基因pgsBCAE的克隆與表達

王世鋒1，2何劍1，2陳怡露1鄭濤1，2沈其榮3雍曉雨1，2

（1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京211816；2. 南京工業(yè)大學 生物能源研究所，南京211816；3.南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京210095）

γ-PGA是微生物合成的一種新型高分子生物可降解材料，基因工程菌株的構(gòu)建對于其合成機理及開發(fā)生產(chǎn)具有較高的研究價值。利用Self-Formed Adaptor PCR（SEFA-PCR）方法擴增出菌株B. amyloliqueficiens C1的γ-PGA合成酶基因簇pgsBCAE，將其克隆到表達載體pET29a（+）中并轉(zhuǎn)化至表達宿主E.coli BL21（DE3）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化所得的工程菌株在IPTG誘導(dǎo)下通過搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)0.14 g/L的γ-PGA。Mn2+和Zn2+能夠顯著促進重組子E.coli BL21（pET29α-pgsBCAE）發(fā)酵合成γ-PGA的產(chǎn)量，并且這種促進作用隨著Mn2+和Zn2+濃度的提高而越加顯著。Mg2+在低濃度（1 mmol/L）下也促進重組子合成γ-PGA，之后隨著Mg2+濃度的升高，這種促進作用逐漸減弱，當Mg2+濃度達到4 mmol/L時，反而抑制重組子γ-PGA的合成。菌株B. amyloliqueficiens C1基因組內(nèi)含有完整的γ-PGA合成酶基因簇pgsBCAE，該基因簇能夠在表達宿主E. coli BL21中被誘導(dǎo)表達并合成γ-PGA，且其γ-PGA的合成受金屬離子的影響。

γ-多聚谷氨酸；合成基因；SEFA-PCR；異源表達；金屬離子

γ-多聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是微生物利用D-和/或L-谷氨酸通過α-氨基與γ-羧基之間形成γ-酰胺鍵聚合而成的一種陰離子型高分子聚合物，具有水溶性、可生物降解、可食用等特點，對人體和環(huán)境安全。其分子內(nèi)含有大量游離羧基，對養(yǎng)分具有較大的親和力，同時又具有較強的保濕和吸水性，近年來在食品工業(yè)、化妝品生產(chǎn)、制藥業(yè)、污水處理和農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用［1］。

Green等［2］發(fā)現(xiàn)B. anthracis的γ-PGA合成基因存在于質(zhì)粒pXO2上；而Candela等［3］發(fā)現(xiàn)capB、capC、capA和capE是影響γ-PGA合成最主要的4個基因。Ashiuchi等［4，5］報道了在B. subtilis IFO 3336中有3個基因參與了γ-PGA的合成，分別為pgsB、pgsC和pgsA。Candela等［3］于2005年在該3個基因下游發(fā)現(xiàn)了一小段開放閱讀框，命名為pgsE。該段序列與capE同源性很高，所以pgsE極有可能也參與γ-PGA的合成。B. amyloliqueficiens C1是本實驗室自行從菜園土中篩選的一株高產(chǎn)γ-PGA的菌株，其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量能夠達到18.4 g/L，相對分子質(zhì)量為1.8×103kD，且PCR結(jié)果顯示該菌株擁有γ-PGA合成所需的相關(guān)基因pgsABC。B. licheniformis［6］和B. subtilis natto［7］等菌株常被用來生產(chǎn)γ-PGA，但野生菌株的遺傳不穩(wěn)定性可能會導(dǎo)致γ-PGA合成能力的降低甚至喪失，γ-PGA的降解，以及在某些生長狀態(tài)下產(chǎn)生大量的胞外多糖類副產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的誘變育種相比，新興的基因工程手段有望成為γ-PGA 高產(chǎn)菌的有效改造方式。馬婕等［8］將B. subtilis 168模式菌株的γ-PGA合成基因ywsC、ywtA和ywtB連接到pTrcHisA載體后轉(zhuǎn)化至宿主菌E. coli BL21（DE3），其γ-PGA產(chǎn)量最高可達0.134 g/L。Ashiuchi等［4］將pgsBCA基因通過融合表達的手段克隆到pTrc99A質(zhì)粒中，并將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli JM109中，獲得的陽性克隆中能夠得到0.024 g/L的γ-PGA。Jiang等［9］將B. subtilis subsp. chungkookjang中的pgsBCA基因分別克隆到以Ptrc和PHCE為啟動子的質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pMpgsBCA和pCOpgs，然后將這兩個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E. coli BL21（DE3）、W3110及FMJ123中，結(jié)果轉(zhuǎn)入了pMpgsBCA的E. coli BL21（DE3）合成了最高產(chǎn)量的γ-PGA，為0.061 g/L。

本研究以B. amyloliquefaciens C1基因組的 DNA為模板，擴增出γ-PGA合成基因pgsBCAE后，將其克隆入表達載體 pET29a（+）中，該載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）后發(fā)酵，并設(shè)法提高重組菌中γ-PGA的產(chǎn)量，旨在為以B. amyloliquefaciens C1為基礎(chǔ)構(gòu)建高產(chǎn)γ-PGA 的工程菌提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 菌株和質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH7.0；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：檸檬酸13.5，谷氨酸10，NH4Cl 6.8，甘油75，K2HPO41，pH7.2分別加入：（1）0、0.1、0.2和0.4 mmol/L的ZnCl2；（2）0、0.1、0.2和0.4 mmol/L的FeCl3；（3）0、1、2和4 mmol/L的MgSO4；（4）0、0.2、0.4和0.8 mmol/L的MnSO4；Taq酶、LA Taq酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、GCbuffer、T4 DNA連接酶等分子試劑均購自TaKaRa公司；抗生素均購自上海生物工程有限公司。

1.1.3 抗生素 氨芐青霉素（Amp）濃度為100 μg/mL，卡那霉素（Kan）濃度為50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 基因組 DNA和質(zhì)粒 DNA 的提取 采用Axy-Prep細菌基因組DNA小量試劑盒提取目標菌株基因組DNA，采用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit試劑盒提取質(zhì)粒，具體方法參見說明書。

1.2.2 pgsBCAE基因的SEFA-PCR擴增

1.2.2.1 PCR 擴增引物 本研究所用引物見表2。

表2 引物序列

1.2.2.2 pgsB基因的PCR擴增 利用引物pgsB-S和pgsB-AS（表2），以菌株 C1 的總 DNA 為模板擴增 pgsB 基因片段。PCR 反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 90 s，32個循環(huán)；72℃，10 min；10℃，10 min。

1.2.2.3 SEFA-PCR法擴增pgsBCAE的全長基因 根據(jù)已獲得的pgsB基因序列設(shè)計SEFA-PCR引物（表2），上游引物為5SP1、5SP2和5SP3，下游引物為3SP1、3SP2和3SP3，然后利用SEFA-PCR法［9］獲得pgsB基因的上下游序列，測序后對上下游片段進行拼接，在NCBI網(wǎng)站中進行序列比對，并用Omiga軟件進行序列分析。SEFA-PCR擴增體系和反應(yīng)條件如下：

（1）SEFA-PCR-1：只加SP3作為引物。

SEFA-PCR-1體系（30 μL）：2×GC Buffer 15 μL；dNTP 5 μL；模板DNA 3 μL；SP3（5SP3或3SP3）1 μL；LA-Taq 0.5 μL；ddH2O 5.5 μL。

SEFA-PCR-1反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s；35℃ 3 min；0.2℃/s直到72℃；72℃ 5 min。

（2）SEFA-PCR-2：保持SEFA-PCR-1最后一步72℃，加3 μL SP1（5SP1 or 3SP1）。

SEFA-PCR-2反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s；56℃ 5 min；72℃ 5 min；Go to 2 step 25 cycles；94℃30 s；56℃ 5 min；72℃ 5 min；Go to 6 step 1 cycle；94℃ 30 s；50℃ 30 s；72℃ 5 min；Go to 6 step 10 cycles；72℃ 6 min；10℃ forever；End。

（3）SEFA-PCR-3：以SEFA-PCR-2的產(chǎn)物（稀釋10倍）為模板，只加 SP2 作為引物。

SEFA-PCR-3體 系（30 μL）：2×GC Buffer 15 μL；dNTP 4 μL；模板DNA 2 μL；SP3（5SP3或3SP3）1 μL；LA-Taq 0.5 μL；ddH2O 7.5 μL。

SEFA-PCR-3反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s；56℃ 5 min；72℃ 5 min；Go to 2 step 30 cycles；72℃10 min；10℃ forever；End。

1.2.3 重組表達載體的構(gòu)建

1.2.3.1 pgsBCAE 基因的 PCR 擴增 根據(jù)SEFAPCR測序結(jié)果最終拼接的pgsBCAE全長基因設(shè)計引物，并在正向和反向引物前分別加入Kpn I酶切位點和BamH I酶切位點（表2）。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化、酶連、轉(zhuǎn)化、陽性轉(zhuǎn)化子驗證、質(zhì)粒提取、序列測定，最終獲得含有質(zhì)粒pMD-pgsBCAE的陽性轉(zhuǎn)化子，并提取質(zhì)粒pMD-pgsBCAE。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：5×Prime STAR Buffer（Mg2+plus）10 μL；dNTP 4 μL；pgsBCAE-F 1 μL；pgsBCAE-R 1 μL；DNA 1 μL；PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL；ddH2O 32.5 μL。

PCR反應(yīng)條件為：98℃ 2 min；98℃ 10 s；52℃15 s；72℃ 3.5 min；Go to 2 step 30 cycles；72℃ 10 min；10℃ forever；End。

1.2.3.2 DNA的酶切反應(yīng) Kpn I酶切反應(yīng)于37℃過夜進行，BamH I酶切反應(yīng)于30℃過夜進行。檢測型酶切反應(yīng)結(jié)束后加10%（V/V）電泳上樣緩沖液中止酶切反應(yīng)，并進行瓊脂糖電泳檢測，制備型酶切反應(yīng)結(jié)束后切膠回收。

（1）制備型酶切反應(yīng)體系（100 μL）：10 × Buffer 10 μL；質(zhì)粒DNA 70 μL；限制性內(nèi)切酶5 μL；ddH2O 15 μL。

（2）檢測型酶切反應(yīng)體系（10 μL）：10 × Buffer 1 μL；質(zhì)粒DNA 7 μL；限制性內(nèi)切酶1 μL；ddH2O 1 μL。

1.2.3.3 目的基因片段的獲得 參照制備型酶切體系，用Kpn I和BamH I進行分步酶切，電泳檢查酶切效果。對已完全酶切的產(chǎn)物進行切膠回收，溶解于50 μL ddH2O中，核酸定量儀檢測DNA濃度，立即酶連或于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.4 表達載體pET29a的制備 參照制備型酶切體系，用Kpn I和BamH I進行分步酶切，電泳檢查酶切效果。對已完全酶切的產(chǎn)物進行切膠回收，溶解于50 μL ddH2O中，核酸定量儀檢測DNA濃度，立即酶連或于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.5 pgsBCAE重組表達載體的構(gòu)建 將B. amyloliquefaciens C1菌株合成γ-PGA完整的基因簇pgs-BC-AE克隆到表達載體pET29a（+）中，轉(zhuǎn)化至表達宿主載體E. coli BL21感受態(tài)細胞中，在T7 lacZ啟動子的控制下，進行異源表達，以此構(gòu)建γ-PGA合成基因工程菌株。重組表達載體設(shè)計路線如圖1所示。

圖1 重組表達載體pET29a（+）-pgsBCAE構(gòu)建技術(shù)路線

1.2.3.6 酶連、轉(zhuǎn)化 酶連反應(yīng)于16℃過夜進行，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，挑取驗證陽性轉(zhuǎn)化子后，提取質(zhì)粒送去測序。將經(jīng)測序驗證正確的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細胞，挑取驗證陽性轉(zhuǎn)化子后，最終獲得含有pET29-pgsBCAE重組表達載體的轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 pgsBCAE的誘導(dǎo)表達 挑取E. coli BL21菌落，接入3 mL含卡那霉素（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜。取500 μL過夜培養(yǎng)物接入50 mL含卡那霉素（50 μg/mL）的液體發(fā)酵培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng) 2 h以上，至對數(shù)中期（OD600=0.5）。吸取1 mL 未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物至微量離心管中，置于4℃冰箱待用。在剩余培養(yǎng)物中加入IPTG 至終濃度1 mmol/L，30℃、180 r/min繼續(xù)通氣培養(yǎng)。

1.2.5 金屬離子對pET29-pgsBCAE轉(zhuǎn)化子合成γ-PGA的影響 配制0.01 mol/L的ZnCl2、0.02 mol/L MnCl2、0.1 mol/L MgCl2，分別加入γ-PGA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別使得：Zn2+濃度為0、0.1、0.2和0.4 mmol/L；Mn2+濃度為0、0.2、0.4和0.8 mmol/L；Mg2+濃度為0、1.0、2.0和4.0 mmol/L。檢測不同金屬離子及其濃度對pET-pgsBCAE轉(zhuǎn)化子合成γ-PGA的影響。

1.2.6 γ-PGA的提取純化 發(fā)酵液15 000×g離心20 min后，取上清，加入4倍體積的預(yù)冷無水乙醇，靜置過夜，12 000×g離心，沉淀用去離子水溶解后，去離子水透析過夜（透析袋截留分子量9 kD），冷凍干燥得到固體初提物。初提物用去離子水溶解，12 000×g離心，上清加20 mg/mL蛋白酶K，去離子水透析過夜，再按上述方法離心，取上清冷凍干燥，得到γ-PGA固體純化樣品，-70℃保存。

1.2.7 γ-PGA的水解 取純化的γ-PGA樣品0.2 g放入水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl，抽真空，維持1 min后封口，110℃水解12-24 h，冷卻后過濾，再用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀除去鹽酸濃縮，洗提3次，最后定容到10 mL。

1.2.8 γ-PGA的水解產(chǎn)物氨基酸分析 采用Biochrom 30專用自動氨基酸分析系統(tǒng)測定所得水解產(chǎn)物中游離谷氨酸含量，上樣量為20 μL。

2 結(jié)果

2.1 pgsB基因的PCR擴增

用常規(guī)PCR方法擴增出pgsB基因片段，測序結(jié)果（圖2）顯示其長度為1 182 bp。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)該序列與B. amyloliquefaciens LL3菌株的pgsB基因（登錄號HM034756.1）同源性達到100%，同時申請NCBI登錄號（HQ599194.1）。

圖2 pgsB基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 pgsB基因片段上、下游序列的SEFA-PCR擴增

圖3 pgsB基因片段上游（A）、下游（B）序列的SEFAPCR擴增圖

擴增結(jié)果如圖3所示。對上、下游擴增片段（圖3-A3、B3泳道）進行切膠回收并純化后，酶連到克隆載體pMD19-T上并轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)，挑選陽性轉(zhuǎn)化子送測序，結(jié)果顯示，利用SEFA-PCR擴增出的pgsB基因上游片段為3 295 bp，下游片段為2 484 bp。

2.3 上、下游序列的拼接與分析

利用DNAMan軟件對pgsB基因上下游序列進行拼接，并用OMIGA軟件進行ORF（open reading frame）分析。結(jié)果（圖4）表明，獲得了γ-PGA完整的合成基因，共4個ORF，分別為pgsB、pgsC、pgsA和pgsE，并在pgsB上游發(fā)現(xiàn)750 bp的非編碼區(qū)域，可能是其調(diào)控序列。完整的pgsBCAE基因序列為2 995 bp，與模式菌株B. amyloliquefaciens FZB42（登錄號CPOOO560.1）、B. amyloliquefaciens DSM7（登錄號FN597644.1）的γ-PGA合成酶基因同源性達到了100 %。

圖4 pgsBCAE基因序列的ORF分析

2.4 pgsBCAE基因簇中各基因的驗證

按照SEFA-PCR擴增出的pgsBCAE序列分別設(shè)計PCR擴增pgsBCAE完整基因簇及單個基因pgsB、pgsC、pgsA、pgsE的引物，并以菌株B. amyloliquefaciens C1基因組DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果（圖5）顯示，能夠擴增出pgsBCAE以及pgsB、pgsC、pgsA、pgsE四個基因。

圖5 SEFA-PCR結(jié)果的驗證

2.5 pgsBCAE重組表達載體的構(gòu)建

以菌株B. amyloliquefaciens C1的基因組DNA為模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶擴增pgsBCAE基因，并利用引物在其兩端分別引入Kpn I和BamH I酶切位點。將PCR產(chǎn)物經(jīng)末端加A尾后酶連入pMD19-T vector，經(jīng)轉(zhuǎn)化后獲得pMD19-pgsBCAE。用Kpn I和BamH I分步單酶切pMD19-pgsBCAE及pET29a（+）?；厥针p酶切后的 pgsBCAE片段（3 kb左右）與pET29a（+）載體（5.5 kb左右），將獲得的兩片段通過T4連接酶催化反應(yīng)進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TOP10菌株，轉(zhuǎn)化后的菌株發(fā)酵并提取質(zhì)粒，篩選陽性克隆。將所得重組質(zhì)粒測序驗證，并將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進E. coli BL21感受態(tài)中，獲得含有重組表達載體pET29-pgsBCAE的基因工程菌株。各步驟的電泳檢測圖譜見圖6。

2.6 重組子γ-PGA產(chǎn)量分析

對重組子γ-PGA合成基因pgsBCAE進行IPTG誘導(dǎo)表達，并提取其發(fā)酵液中γ-PGA。由圖7可知，重組子E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）在γ-PGA發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后能夠合成0.14 g/L的γ-PGA。說明在IPTG誘導(dǎo)下，重組子中γ-PGA合成基因能夠高效表達。

2.7 金屬離子對重組子γ-PGA產(chǎn)量的影響

Zn2+、Mg2+和Mn2+對重組子E. coli BL21（pET-29a-pgsBCAE）發(fā)酵合成γ-PGA的產(chǎn)量有顯著影響（圖8）。Zn2+濃度為0.1 mmol/L時就能夠促進重組子E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）γ-PGA的合成，此時γ-PGA的產(chǎn)量為0.27 g/L，隨著Zn2+濃度的提高，其對E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）γ-PGA的合成促進效果越顯著，并且在Zn2+濃度為0.4 mmol/L達到最大，此時γ-PGA的產(chǎn)量達到0.66 g/L，相較于CK提高了370%。Mn2+顯示出與Zn2+類似的促進效果，并且在Mn2+濃度為0.8 mmol/L時，γ-PGA的產(chǎn)量達到0.53 g/L，相較于CK提高了280%。與Zn2+和Mn2+不同，Mg2+在低濃度（1 mmol/L）條件下對重組子合成γ-PGA的促進作用達到最大（0.49 g/L），之后隨著Mg2+濃度的升高，這種促進作用逐漸減弱，當Mg2+濃度達到4 mmol/L時，反而抑制重組子γ-PGA的合成。此時γ-PGA的產(chǎn)量僅為0.08 g/L，相較于CK下降了42.8%。

圖6 pET29a-pgsBCAE重組質(zhì)粒構(gòu)建電泳檢測圖譜

圖7 重組子E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）合成的γ-PGA水解后氨基酸分析圖

3 討論

目前對γ-PGA合成基因的研究主要集中在B. subtilis。例如Ashiuchi等［4］在1999年發(fā)現(xiàn)在B. subtilis IFO 3336中有3個基因（pgsB、pgsC和pgsA）參與γ-PGA的合成。2001年，他們又在B. subtilis（chungkookjang）中將pgsB、pgsC 和 pgsA基因敲除，于是突變株無法合成γ-PGA，證明這3個基因是γ-PGA合成所必需的［5］。而通常對γ-PGA合成基因的研究也僅僅是針對pgsBCA三個基因及其產(chǎn)物PgsB、PgsC和PgsA。PgsB具有酰胺連接酶活性，其N-端有一段疏水區(qū)，此區(qū)域與PgsB和細胞膜、PgsC、PgsA的連接緊密相關(guān)，被認為是催化合成γ-PGA的主要組分［11］。PgsA含有與細胞膜結(jié)合的位點，并可在細胞表面定位。PgsA的功能是從γ-PGA的合成酶系中轉(zhuǎn)移合成的γ-PGA，并使γ-PGA的合成酶系穩(wěn)定地錨定在細胞膜上，因此PgsA是γ-PGA的運輸載體，并對γ-PGA的延長十分重要［5］。PgsC是γ-PGA合成酶系統(tǒng)中可以與細胞膜結(jié)合的組分之一，也是γ-PGA的合成所必需［12］。而在2010年，Yamashiro等［13］發(fā)現(xiàn)，在pgsBCA之后還有一個168 bp的ORF，能夠編碼一個由55個氨基酸殘基組成的6.5 kD大小的蛋白，該蛋白能夠促進B. subtilis菌株γ-PGA的合成，并且Zn2+能夠激活該蛋白的活性。這個基因即為pgsE。本研究最初擬根據(jù)報道的B. subtilis的γ-PGA合成基因為模板設(shè)計引物，擴增B. amyloliqueficiens C1菌株γ-PGA合成基因，但是只有pgsB能夠被擴增出，而pgsA、pgsC以及pgsBCA全長基因簇始終擴增不出。這可能是因 為 B. subtilis與B. amyloliqueficiens的γ-PGA合成基因存在差異。Self-Formed Adaptor PCR（SEFAPCR）是由王世明博士設(shè)計開發(fā)的一種新的PCR技術(shù)，能夠由已知序列擴增其兩端未知序列擴增，擴增片段最長可達6-8 kb［10］。因此，作者以已擴增出的pgsB基因序列為模板設(shè)計SEFA-PCR引物，擴增pgsB基因的上下游片段，測序后拼接獲得B. amyloliqueficiens C1菌株合成γ-PGA的基因簇全長。上游序列引物為：5SP1、5SP2、5SP3，下游序列引物為：3SP1、3SP2、3SP3。本研究通過SEFA-PCR擴增，作者也在B. amyloliqueficiens C1菌株pgsBCA基因后發(fā)現(xiàn)了這個小片段的ORF。因此后期實驗中主要針對pgsBCAE基因簇進行研究。

圖8 金屬離子及其濃度對重組子pET29a-pgsBCAE的γ-PGA產(chǎn)量的影響

在γ-PGA合成過程中有許多酶類參加反應(yīng)，而金屬離子在保持酶的活性中心構(gòu)象以及維持酶活性有重要的作用［14］。培養(yǎng)基中金屬離子濃度對γ-PGA的生產(chǎn)具有重要的影響，例如PgsB上有Mg2+/ATP結(jié)合位點［12］。研究發(fā)現(xiàn)Mn2+、Mg2+等對B. subtilis合成γ-PGA有影響［15，16］。高濃度的Mn2+抑制B. subtilis的生長，但是卻可以延長細胞生存能力進而提高γ-PGA的產(chǎn)量［16，17］。Mn2+、Mg2+可能控制著專一性很強的D-和L-多肽合成酶系統(tǒng)。γ-PGA的聚合度和D-/L-構(gòu)型比率都與金屬離子的濃度有密切關(guān)系，不同濃度的Mn2+直接影響γ-PGA中L-谷氨酸、D-谷氨酸的比例，例如培養(yǎng)基中Mn2+的濃度也可改變B. licheniformis ATCC 9945A合成γ-PGA中D-谷氨酸與L-谷氨酸的比例［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+和Zn2+能夠顯著促進重組子E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）發(fā)酵合成γ-PGA的產(chǎn)量，并且這種促進作用隨著Zn2+濃度的提高而越加顯著。但是Mg2+的作用與Zn2+和Mn2+不同。Mg2+在低濃度（1 mmol/L）條件下對重組子合成γ-PGA的促進作用達到最大（0.49 g/L），之后隨著Mg2+濃度的升高，這種促進作用逐漸減弱，當Mg2+濃度達到4 mmol/L時，反而抑制重組子γ-PGA的合成。此時γ-PGA的產(chǎn)量僅為0.08 g/L。因此在以后的發(fā)酵培養(yǎng)中，可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中金屬離子（如Mn2+、Zn2+、Mg2+）的種類和濃度對發(fā)酵菌株生產(chǎn)γ-PGA進行調(diào)節(jié)。

本研究將重組載體轉(zhuǎn)化入E. coli BL21宿主菌中，在IPTG誘導(dǎo)下，使其具有了γ-PGA生物合成能力。但是由于E. coli為革蘭氏陰性菌，而野生菌株（B. amyloliqueficiens C1）為革蘭氏陽性菌，兩者細胞膜結(jié)構(gòu)不同，且蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)也存在差異，可能導(dǎo)致重組表達的γ-PGA合成酶系統(tǒng)不能很好地在細胞膜上定位［19］，因此表達宿主菌E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）的 γ-PGA產(chǎn)量較低。另外，載體質(zhì)粒的表達體系的影響也是引起表達量較低的可能原因之一。后期研究中，為了構(gòu)建高效γ-PGA生產(chǎn)的基因工程菌，可以從以下幾點入手：（1）將γ-PGA合成酶基因轉(zhuǎn)入芽孢桿菌表達系統(tǒng)中進行表達；（2）在重組質(zhì)粒γ-PGA合成酶基因之間加上強啟動子增強其表達。

4 結(jié)論

利用SEFA-PCR方法成功克隆出B. amylolique-ficiens C1合成γ-PGA的完整基因簇pgsBCAE，并將其連接到表達載體pET29a后轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21，由此構(gòu)建的重組菌株E.coli BL21（pET29apgsBCAE）具備合成γ-PGA的能力，產(chǎn)量達到0.14 g/L。且發(fā)現(xiàn)其γ-PGA的合成能力受金屬離子的影響。

［1］Candela T， Fouet A. Poly-gamma-glutamate in bacteria［J］. Molecular Microbiology， 2006， 60（5）：1091-1098.

［2］Green BD， Battisti L， Koehler TM， et al. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis［J］. Infection and Immunity， 1985，49（2）：291-297.

［3］Candela T， Mock M， Fouet A. CapE， a 47-amino-acid peptide， is necessary for Bacillus anthracis polyglutamate capsule synthesis［J］. Journal of Bacteriology， 2005， 187（22）：7765-7772.

［4］Ashiuchi M， Soda K， Misono H. A poly-γ-glutamate synthetic system of Bacillus subtilis IFO 3336：gene cloning and biochemical analysis of poly-γ-glutamate produced by Escherichia coli clone cells［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，1999， 263（1）：6-12.

［5］Ashiuchi M， Nawa C， Kamei T， et al. Physiological and biochemical characteristics of poly-γ-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis［J］. European Journal of Biochemistry， 2001， 268（20）：5321-5328.

［6］Birrer GA， Cromwick AM， Gross RA. γ-Poly（glutamic acid）formation by Bacillus licheniformis 9945a：physiological and biochemical studies［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 1994， 16（5）：265-275.

［7］Kunioka M， Goto A. Biosynthesis of poly（γ-glutamic acid）from L-glutamic acid， citric acid， and ammonium sulfate in Bacillus subtilis IFO3335［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，1994， 40（6）：867-872.

［8］ 馬婕， 王丹， 李強， 等. 基因工程大腸桿菌合成γ-聚谷氨酸［J］.過程工程學報， 2009， 9（4）：791-795.

［9］ Jiang H， Shang L， Yoon SH， et al. Optimal production of poly-γglutamic acid by metabolically engineered Escherichia coli［J］. Biotechnology Letters， 2006， 28（16）：1241-1246.

［10］ Wang S， He J， Cui Z， et al. Self-formed adaptor PCR：a simple and efficient method for chromosome walking［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73（15）：5048-5051.

［11］Urushibata Y， Tokuyama S， Tahara Y. Characterization of the Bacillus subtilis ywsC gene， involved in γ-polyglutamic acid production［J］. Journal of Bacteriology， 2002， 184（2）：337-343.

［12］Ashiuchi M. Amino-acid homopolymers occurring in nature［M］. Berlin：Springer-Verlag， 2010：77-93.

［13］Yamashiro D， Yoshioka M， Ashiuchi M. Bacillus subtilis pgsE（formerly ywtC）stimulates poly-γ-glutamate production in the presence of zinc［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2011，108（1）：226-230.

［14］ 邵麗. 產(chǎn)聚γ-谷氨酸菌株的篩選［D］. 濟南：山東輕工業(yè)學院，2008.

［15］ Thorne CB， Gomez GC， Noyes HE， et al. Production of glutamyl polypeptide by Bacilllus subtilis［J］. Journal of Bacteriology，1954， 68（3）：307-315.

［16］Leonard CG， Housewright RD， Thorne CB. Effects of some metallic ions on glutamyl polypeptide synthesis by Bacillus subtilis［J］. Journal of Bacteriology， 1958， 76（5）：499-503.

［17］Cromwick AM， Gross RA. Effects of manganese（Ⅱ）on Bacillus licheniformis ATCC 9945A physiology and poly（γ-glutamic acid）formation［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 1995， 17（5）：259-267.

［18］王啟軍. 枯草芽孢桿菌B6-1產(chǎn)脂肽和聚-γ-谷氨酸及抗幾種植物病原菌的研究［D］. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學， 2008.

［19］Buescher JM， Margaritis A. Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer and applications in the biopharmaceutical，biomedical and food industries［J］. Critical Reviews in Biotechnology， 2007， 27（1）：1-19.

（責任編輯 馬鑫）

Clone and Heterologous Expression of the Poly-γ-glutamic Acid Synthesis Gene pgsBCAE from Bacillus amyloliquefaciens C1

Wang Shifeng1，2He Jian1，2Chen Yilu1Zheng Tao1，2Shen Qirong3Yong Xiaoyu1，2
（1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing TECH University，Nanjing211816；2. Bioenergy Research Institute，Nanjing TECH University，Nanjing211816；3. College of Resources and Environmental Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095）

Poly-γ-glutamic acid（γ-PGA）， a new type of biodegradable material with high molecular weight， is synthesized by many microbes； the construction of genetic engineering strain will be highly valuable to the research of synthesis mechanism and production of γ-PGA. The gene cluster， pgsBCAE， involving in the biosynthesis of γ-PGA in Bacilus amyloliqueficiens C1 were amplified by SEFA-PCR， which were then ligated in expression vector pET29a（+）and transformed into E. coli BL21（DE3）host cells. The recombinant clone， E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）induced by IPTG obtained the ability to synthesize γ-PGA by fermentation in shake flask， and the yield of γ-PGA was 0.14 g/L. Both Mn2+and Zn2+increased γ-PGA production of E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）. With the increase of the concentration of Mn2+and Zn2+，this promotion became much more significantly. On the other hand， Mg2+in low concentration（1 mmol/L）also promoted γ-PGA production， the promotion decreased with the increase of Mg2+concentration， while high concentration of Mg2+（4 mmol/L）inhibited γ-PGA production of the recombinant clone significantly. The above results suggested that Bacilus amyloliqueficiens C1 contained the intact gene cluster pgsBCAE for the synthesis of γ-PGA， which can be cloned and expressed in E. coli BL21. The production of γ-PGA in the genetic engineering strain was affected by several metal ions.

poly-γ-glutamic acid；synthesis gene；SEFA-PCR；heterologous expression； metal ions

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.025

2014-09-22

江蘇省自然科學基金項目（BK20130932），江蘇省高校自然科學基金項目（13KJB530009）

王世鋒，男，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵工程；E-mail：sg3ever@126.com

雍曉雨，男，博士，講師，研究方向：應(yīng)用微生物；E-mail：yongxiaoyu@njtech.edu.cn