彭傳林魏川川吳建偉王宇，3修江帆尚小麗趙學(xué)軍

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，貴陽　550004；2.皖北煤電集團總醫(yī)院，宿州　234000；3.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽　550004）

家蠅抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表達及序列分析

彭傳林1，2魏川川1吳建偉1王宇1，3修江帆1尚小麗1趙學(xué)軍1

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，貴陽550004；2.皖北煤電集團總醫(yī)院，宿州234000；3.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽550004）

旨在對家蠅抗真菌肽MAF-1-溶菌酶（LZM）基因進行生物信息學(xué)分析，并進行融合基因MAF-1-LMZ的克隆和表達分析。從GenBank獲得家蠅抗真菌肽MAF-1和溶菌酶LZM的編碼序列，分析和預(yù)測這兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。PCR擴增融合蛋白質(zhì)抗真菌肽-溶菌酶的基因 MAF-1-LMZ，將其克隆到原核表達載體pET-28a中，重組質(zhì)粒pET-28a-MAF-1-LMZ在大腸桿菌OrigmiB/DE3中經(jīng)用IPTG誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物MAF-1-LMZ通過SDS-PAGE電泳進行鑒定，采用小試管法倍比稀釋法進行活性驗證。結(jié)果顯示，融合蛋白質(zhì)MAF-1-LMZ序列的ORF為969 bp，編碼322個氨基酸殘基，理論分子量為35 468.6 Da，等電點為8.31，在大腸桿菌OrigmiB/DE3中得到成功表達。其純化后的目的蛋白具有抗真菌活性。

家蠅；抗真菌肽-溶菌酶；重組表達；序列分析

深部真菌感染日益成為導(dǎo)致腫瘤放化療、器官移植及艾滋病等免疫力低下病人死亡的主要原因［1］，嚴(yán)重威脅著人類的健康［2，3］。抗真菌藥物較為有限，其本身具有毒副作用并且耐藥現(xiàn)象日益增加。尋求和研發(fā)安全有效的抗真菌藥至關(guān)重要。本課題組前期研究中，家蠅抗真菌肽MAF-1（Musca domestica antifungalpeptide-1）在體外被驗證具有抗真菌活性，可能是一種全新的以α螺旋為主的線性昆蟲抗真菌肽［4］。家蠅溶菌酶（lysozyme，LZM）是一類非特異性免疫因子，在機體的先天免疫中發(fā)揮重要作用，可破壞菌體胞壁、導(dǎo)致細(xì)菌死亡，而對人體無毒副作用［5］。為了尋求新型的抗菌蛋白質(zhì)或抗真菌-抗細(xì)菌融合蛋白質(zhì)，近年來國內(nèi)外先后報道了有關(guān)抗菌肽類基因以及與其它相關(guān)基因融合的克隆和表達［6-10］，Lu等［11］報道了家蠅天蠶素與人溶菌酶融合表達。但目前將家蠅的抗真菌肽MAF-1與抗細(xì)菌的溶菌酶LZM進行融合表達未見報道。將二者構(gòu)建成融合蛋白質(zhì)，使其具有真菌肽和溶菌酶的活性，降低細(xì)菌的耐受性，對家蠅抗真菌肽和家蠅溶菌酶作為新藥研發(fā)具有重要意義。本研究利用酶切、連接重組家蠅抗真菌肽MAF-1與家蠅溶菌酶LZM的基因，對其編碼的重組蛋白質(zhì)MAF-1-LMZ結(jié)構(gòu)特征進行預(yù)測分析和克隆表達，旨在為進一步研究該重組融合基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 家蠅，由貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室常規(guī)飼養(yǎng)；載體pET-28a、大腸桿菌菌株DH5α、OrigmiB/DE3由貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室常規(guī)保存。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III及Xho I、T4連接酶、rTaq酶、DNA Marker、Protein Marker、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒均購于大連寶生物科技公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR擴增儀（德國Eppendorf公司）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國GE公司）；紫外分光光度計（美國GE公司）；Millipore 0.22 μm/0.45 μm濾器（美國Merck Millipore公司）；Milli-Q超純水儀（法國Mill-ipore Pharmacia公司）。

1.1.3 引物合成和DNA測序 基因擴增引物和重組質(zhì)粒DNA測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MAF-1、LMZ基因的識別 利用美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站的ORF Finder（開放閱讀框探尋器）確定其完整編碼序列和編碼的氨基酸序列。利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert Protein Analysis Systerm，ExPASy，http：//ca.expasy.org/）Proteomics Server（http：//ca.expasy.org/）所提供的蛋白質(zhì)在線分析工具，如protparam（http：//au.expasy. org/tools/protparam.html）預(yù)測氨基酸序列的分子量、等電點、穩(wěn)定性指數(shù)等理化性質(zhì)；InterPro Scan（http：//www.ebi.ac.uk/InterProScan/）預(yù)測氨基酸序列中的功能域；Sec（https：//www.predictprotein. org/upgrade/Sec/）預(yù)測氨基酸序列中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

1.2.2 MAF-1-LMZ融合基因的擴增 利用prmer5.0軟件，根據(jù)GenBank獲得家蠅抗真菌肽（登錄號：HM178948）和家蠅溶菌酶（登錄號：XP_0051784-89.1）基因序列和pET-28a多克隆位點設(shè)計特異性引物。引物為：MAF-1 F：5'-GGAATTCGAATCTGCCCCCGCCCCTGAGGT-3'，MAF-1 R ：5'-CCCAAGCTTGGCATGGGGCTTCATTTCCTTGGC-3'，下劃線為EcoR I 和Hind III限制性酶切位點；LMZ F：5'-GCCAAG CTTATGTACAACATTTCTGGTT-3'，LMZ R：5'-CGGC TCGAGTCAAAAACAATCATCAACACT-3'，下劃線為Hind III和Xho I限制性酶切位點。

從家蠅3齡幼蟲提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板分別進行PCR擴增。MAF-1 PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。LMZ PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.3 重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將回收的目的基因MAF-1、LMZ及表達載體pET-28a分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I 和Hind III；Hind III和Xho I；EcoR I和Xho I進行雙酶切。并將目的基因酶切產(chǎn)物按一定比例與表達載體pET-28a酶切產(chǎn)物連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌OrigmiB/DE3感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽性克隆。對陽性克隆提取質(zhì)粒進行PCR、雙酶切和測序鑒定。

1.2.4 MAF-1-LMZ在大腸桿菌Origmi/DE3中的誘導(dǎo)表達 取50 μL培養(yǎng)過夜的陽性克隆菌液，加入含卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中（菌液/培養(yǎng)基為1/100），37℃，250 r/min振搖至OD600為0.6時，加入IPTG至終濃度0.25 mmol/L誘導(dǎo)表達16 h。離心收集菌體，在沉淀中加入80 mL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸8-10 min，12 000 r/min離心取上清10 μL進行15% SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組蛋白的大量誘導(dǎo)、純化 按照上述方法對陽性克隆進行大量誘導(dǎo)表達，離心收集菌體，按每克菌體加入3 mL細(xì)菌細(xì)胞壁裂解液重懸菌體，反復(fù)凍融后冰上超聲裂解（功率150 W，持續(xù)1 s，停3 s，共180 s），4℃，12 000 r/min，離心20 min后收集上清，分別取上清和沉淀樣品處理后進行SDSPAGE判斷該重組蛋白的可溶性。收集上清，用0.45 μL濾膜過濾，參照鎳離子金屬螯合劑親和層析柱說明書進行蛋白純化，收集蛋白洗脫液，再將洗脫的目的蛋白在PBS透析液（pH7.4）中4℃透析24 h。并根據(jù)說明書，用Bradford法對經(jīng)過以上步驟獲得的重組蛋白進行蛋白定量，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 重組蛋白質(zhì)MAF-1-LMZ抗真菌活性檢測 將白色念珠菌Candida albicans ATCC10231制備成新鮮的菌懸液每毫升含1×107個菌細(xì)胞。在無菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進行，分別于每孔中加入50 μL滅菌雙蒸水后，向第一孔加入50 μL純化后的重組蛋白質(zhì)，混勻后從第一孔中吸取上述混合液50 μL加入到第二孔，以此類推做倍比稀釋，再向每孔中加入菌懸液50 μL，設(shè)置無菌蒸餾水為陰性對照，氟康唑為陽性對照，充分混勻后于30℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物接種至培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24 h后，觀察有無菌落生長并對菌落計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 MAF-1-LMZ基因序列及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測

圖1 MAF-1-LMZ序列及其ORF編碼的氨基酸序列

MAF-1基因編碼序列包含一個完整的開放閱讀框（ORF）為537 bp，編碼178個氨基酸；LMZ基因編碼序列包含一個完整的ORF為435 bp，編碼145個氨基酸。融合基因MAF-1-LMZ編碼序列包含的ORF為969 bp，編碼322個氨基酸（圖1）。ExPASy中ProtParam預(yù)測MDLMZ的理論分子量為35 468.6 Da，等電點為8.31。280 nm處的摩爾消光系數(shù)為39 460 M-1cm-1，0.1%濃度的ABS為1.098。若其成熟肽N-末端為蛋氨酸時，預(yù)測在哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞體外表達的半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中表達的半衰期分別＞20和10 h。預(yù)測MAF-1-LMZ在溶液中不穩(wěn)定指數(shù)為32.29，低于閾值40，其性質(zhì)穩(wěn)定；MAF-1-LMZ的疏水指數(shù)為85.22，疏水性較高。

2.2 MAF-1-LMZ亞細(xì)胞定位分析ExPASy中TargetP預(yù)測

MAF-1-LMZ有信號序列，在第18和19個氨基酸之間有斷裂點，提示MAF-1-LMZ在細(xì)胞外分泌，未發(fā)現(xiàn)線粒體、過氧化酶體、溶酶體和細(xì)胞核等亞細(xì)胞定位序列。

2.3 InterPro Scan分析MAF-1-LMZ蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域

結(jié)果顯示，家蠅抗真菌肽MAF-1-溶菌酶（LZM）融合蛋白中分別含有抗真菌肽MAF-1的結(jié)構(gòu)域（1-178 aa），功能結(jié)構(gòu)域（128-153 aa），是一全新的昆蟲抗真菌肽；溶菌酶（LZM）功能域（182-322 aa），活性位點位于232-250 aa，屬于溶菌酶超家族。

2.4 蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析Sec預(yù)測

α螺旋（H）和無規(guī)卷曲（L）比例是37.67∶53.99，β折疊（E）和無規(guī)卷曲（L）比例是8.34∶53.99，二級結(jié)構(gòu)以α螺旋（H）為主。預(yù)測每個氨基酸的溶劑可及性（solvent accessibility，Acc），超過16%的表面暴露的定義為暴露氨基酸（e），其余氨基酸為包埋氨基酸（b）。從分析結(jié)果來看，一部分氨基酸殘基（39.63%）包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，一部分氨基酸殘基（44.91%）暴露在溶液界面。

2.5 pET28a-MAF-1-LMZ質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

特異性引物分別擴增目的基因MAF-1、LMZ，2%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的基因，獲得約534 bp的MAF-1和435 bp的LMZ兩個片段。將重組質(zhì)粒pET28a-MAF-1-LMZ進行PCR和雙酶切后約在1 000 bp有一清晰的條帶，與目的基因（969 bp）的大小基本相符（圖2），測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒中插入序列正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.6 蛋白表達純化結(jié)果

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-MAF-1-LMZ轉(zhuǎn)化到 E.coli OrigmiB/DE3中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，15% SDS-PAGE分析結(jié)果（圖3第 5、6 泳道）顯示，約在 35 kD左右處出現(xiàn)目的表達條帶。將蛋白進行純化，結(jié)果如圖 4第7泳道所示，證明目的蛋白純化成功。Bradford 法測得該蛋白濃度為0.37 mg/mL。

圖2 重組質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定

圖3 SDS-PAGE分析pET28a-MAF-1-LMZ表達純化效果

2.7 重組蛋白質(zhì)MAF-1-LMZ抗真菌活性

以白色念珠菌（ATCC10231）為指示菌，采用Quantity One克隆菌落計數(shù)法檢測重組蛋白質(zhì)MAF-1-LMZ的抗真菌活性。結(jié)果（表1，圖4）顯示，100 μg/mL的重組蛋白質(zhì)MAF-1-LMZ具有明顯的抗真菌活性。

表1 重組蛋白質(zhì)MAF-1-LMZ的抗真菌效果

3 討論

抗真菌制劑的活性及選擇性是由其與真菌相互作用的方式?jīng)Q定的。白色念珠菌是臨床常見致病菌，白色念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，細(xì)胞壁厚約25 μm，約占細(xì)胞干重的25%，是一種堅韌的結(jié)構(gòu)。其化學(xué)組分較特殊，主要由內(nèi)層的葡聚糖、中間的蛋白質(zhì)分子及外層的甘露聚糖組成。細(xì)胞壁上還含有少量類脂和幾丁質(zhì)。葡聚糖是白色念珠菌細(xì)胞壁含量最高的多糖。大量葡聚糖分子聚集，形成了念珠菌細(xì)胞壁的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［12-14］。溶菌酶主要是通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使菌體細(xì)胞壁出現(xiàn)缺口或被溶解，導(dǎo)致內(nèi)容物外流，從而達到抑制菌體生長或殺滅菌體的作用?？拐婢腗AF-1吸附在白色念珠菌細(xì)胞表面，通過在真菌細(xì)胞質(zhì)膜上形成通道后，進入細(xì)胞逐步在細(xì)胞內(nèi)聚集。抑制真菌生物膜的形成，破壞菌體細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄、細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂［15，16］。另有研究表明，溶菌酶與抗真菌肽具有協(xié)同作用，可能是抗真菌肽破壞細(xì)菌外膜后利于溶菌酶作用于其細(xì)胞壁［17，18］。臨床上聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物治療真菌感染已成共識，其理論基礎(chǔ)是聯(lián)合不同藥物在體內(nèi)的協(xié)同作用，增強殺菌作用，減少單藥在體內(nèi)作用的劑量依賴性，減少藥物的毒副作用。本研究在聯(lián)合用藥的理論基礎(chǔ)上，通過基因重組表達，將MAF-1、LMZ構(gòu)建成融合蛋白，利用融合蛋白協(xié)同作用，更好地發(fā)揮其生物學(xué)活性。

圖4 重組蛋白質(zhì)MAF-1-LMZ抗真菌活性檢測

將目的蛋白在核酸水平上連接，一種連接方法是根據(jù)表達載體上的酶切位點在目的基因兩端分別引入限制性酶切位點，兩端各有限制性酶切位點供目的基因插入連接。另一種連接方法是通過PCR合成，采用低疏水性及低電荷效應(yīng)的氨基酸組成的多肽接頭序列直接包含在重組目的基因當(dāng)中，稱為Gene SOEing［19，20］。本研究采用前者，將限制性酶切位點分別設(shè)計在待擴增的引物中，分別擴增獲得目的基因，將待融合的兩個擴增產(chǎn)物用限制性酶酶切后連接起來。此方法簡便易行，因不需要在基因序列上引入氨基酸組成的多肽接頭序列，從而減少了蛋白酶的攻擊［21-24］。

本研究根據(jù)GenBank中家蠅抗真菌肽與溶菌酶基因分別設(shè)計特異性引物，以家蠅3日齡幼蟲提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，分別成功擴增出目的基因，測序結(jié)果證實與 GenBank獲得家蠅抗真菌肽（登錄號：HM178948）和家蠅溶菌酶（登錄號：XP_005178489.1）序列相符，通過生物信息學(xué)分析顯示該基因序列的ORF為969 bp，編碼322個氨基酸，理論分子量為35 468.6 Da，等電點為8.31。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定成功。SDS-PAGE結(jié)果表明家蠅抗真菌肽-溶菌酶在大腸桿菌OrigmiB/DE3中成功表達。重組質(zhì)粒在大腸桿菌OrigmiB/DE3中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，并成功純化目的蛋白，15% SDS-PAGE分析顯示純化蛋白與目的蛋白分子量大小相符?？拐婢钚詸z測結(jié)果顯示，重組融合蛋白質(zhì)MAF-1-LMZ，其濃度在100 μg/mL時具有明顯的抗真菌活性。說明重組融合蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)表達過程中沒有降解失活，并證實融合蛋白質(zhì)具有抗真菌活性，此研究結(jié)果與劉文麗等［25］報道蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與抗菌活性相關(guān)，以及胡國強等揭示了構(gòu)-效相關(guān)是一致的［26］。這為進一步研究新型抗菌融合蛋白MAF-1-LMZ的生物學(xué)活性及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建pET-28a-MAF-1-LMZ重組原核表達載體并表達出融合MAF-1-LMZ蛋白，對純化條件進行了初探，獲得了純度較高的目的蛋白。實驗顯示重組融合蛋白MAF-1-LMZ具有抗真菌活性。

［1］ 張圣岸， 王盛標(biāo)， 黃強， 等. ICR深部真菌感染的現(xiàn)狀和對策［J］. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報， 2008， 5（3）：98-100.

［2］ Miceli MH， Diaz JA， Lee SA. Emerging opportunistic yeast infections［J］. The Lancet Infect Dis， 2011， 11（2）：142-151.

［3］ Guery BP， Arendrup MC， Auzinger G， et al. Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients：PartⅠ. Epidemiology and Diagnosis［J］. IntensiveCare Med， 2009， 35（1）：55-62.

［4］ Fu P， Wu JW， Guo G. Purification and molecular identification of an antifungal peptide from the hemolymph of Musca domestica（housefly）［J］. Cell Mol Immunol， 2009， 6（4）：245-251.

［5］Masschalck B， Michiels CW. Antimicrobial properties of lysozyme in relation to foodborne vegetative bacteria［J］. Critical Reviews in Microbiology， 2003， 29：191-214.

［6］Arcidiacono S， Soares JW， Meehan AM， et al. Membrane permeability and antimicrobial kinetics ofcecropin P1 against Escherichia coli［J］. J Pept Sci， 2009， 15：398-403.

［7］ Jin FL， Xu XX， Zhang WQ， et al. Expression and characterization of a housefly cecropin gene in the methylotrophic yeast， Pichia pastoris［J］. Protein Expr Purif， 2006， 49（1）：39-46.

［8］ Xu XX， Jin FL， Yu XQ， et al. Expression and purification of a recombinant antibacterial peptide， cecropin， from Escherichia coli［J］. Protein Expr Purif， 2007， 53（2）：293-301.

［9］ Zheng XL， Wang W. High-level expression of housefly cecropin A in Escherichia coli using a fusion protein［J］. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine， 2010， 3（6）：421-426.

［10］ Liang YL， Wang JX， Zhao XF， et al. Molecular cloning and characterization of cecropin from the housefly（Musca domestica），and its expression in Escherichia coli［J］. Dev Comp Immunol，2006， 30（3）：249-257.

［11］ Lu X， Jin X， Zhu J， et al. Expression of the antimicrobial peptide cecropin fused with human lysozyme in Escherichia coli［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2010， 87（6）：2169-2176.

［12］ Brand A， Lee K， Veses V， Gow NA. Calcium homeostasis is required for contact-dependent helical and sinusoidal tip growth in Candida albicans hyphae［J］. Mol Microbiol， 2009， 71（5）：1155-1164.

［13］ Li HL， Liu JG， Huang XT， et al. Characterization， expression and function analysis of DAX1 gene of scallop（Chlamys farreri Jones and Preston 1904）during its gametogenesis［J］. Journal of Ocean University of China， 2014， 13（4）：696-704.

［14］Gao L， Sun R， Liang Y， et al. Cloning and functional expression of a cDNA encoding stearoyl-ACP Delta9-desaturase from the endosperm of coconut（Cocos nucifera L. ）［J］. Gene， 2014， 549（1）：70-76.

［15］Wang K， Yan J， Dang W， et al. Dual Antifungal properties of cationic antimicrobial peptides polybia-MPI：Membrane Integrity disruption and inhibition of biofilm formation［J］. Peptides， 2014， 56：22-29.

［16］Ferre R， Melo MN， Correia AD， et al. Synergistic effects of the membrane actions of cecropin-melittin antimicrobial hybrid peptide BP100［J］. Biophys J， 2009， 96：1815-1827.

［17］ Calle Waert L， Michiels CW. Lysozymes in the animal kingdom［J］. Oiosci， 2010， 35：127-160.

［18］Schmitt P， Mercado L， Diaz M， et al. Characterization and functional recovery of a novel antimicrobial peptide（CECdir-CECret）from inclusion bodies after expression in Esherichia coli［J］. Peptides，2008， 29：512-519.

［19］Xu Z， Zhong Z， Huang L， et al. High-level production of bioactive human beta-defensin-4 in Escherichia coli by soluble fusion expression［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2006， 72：471-479.

［20］ Hsu SY， Lin YS， Li SJ， et al. Co-expression of a heat shock transcription factor to improve conformational quality of recombinant protein in Escherichia coli［J］. Journal of bioscience and bioengineering， 2014， 118（3）：242-248.

［21］ Traxlmayr MW， Obinger C. Directed evolution of proteins for incre-ased stability and expression using yeast display［J］. Arch Biochem Biophys， 2014， 526（2）：174-180.

［22］ Sakamoto S， Taura F， PutalunW， et al. Construction and expression of specificity-improved single-chain variable fragments against the bioactive naphthoquinone， plumbagin［J］. Biol Pharm Bull，2009， 32：434-439.

［23］ Xu Y， Liu J， Liang L， et al. Molecular cloning and characterization of three cDNAs encoding 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase in Aquilaria sinensis（Lour. ）Gilg［J］. Plant physiology and biochemistry， 2014， 82：133-141.

［24］ Zhang R， Xu Y， Xiao R， et al. Optimized expression of（S）-carbonyl reductase in Pichia pastoris for efficient production of（S）-1-phenyl-1， 2-ethanediol［J］. Journal of Basic Microbiology， 2014，54（8）：873-879.

［25］劉文麗， 張?zhí)m威， Josh shi， 等. Ⅱa 類乳酸菌細(xì)菌素構(gòu)效關(guān)系的研究進展［J］. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（21）：369-372.

［26］胡國強， 張忠泉， 王海燕， 等. 氟喹諾酮C3稠雜環(huán)體系的合成及抗腫瘤活性（III）：恩諾沙星均三唑并噻二嗪酮衍生物［J］.化學(xué)學(xué)報， 2009， 67（21）：2592-2596.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning，Expression and Sequence Analysis of Musca domestica Antifungal Peptide-1 and Musca domestica Lysozyme

Peng Chuanlin1，2Wei Chuanchuan1Wu Jianwei1Wang Yu1，3Xiu Jiangfan1Shang Xiaoli1Zhao Xuejun1
（1. Department of Parasitology，Guiyang Medical College，Guiyang550004；2. General Surgery of Wanbei Coal-electricity Group General Hospital，Suzhou234000；3. Guizhou Center for Disease Control and Prevention，Guiyang550004）

The aim of this study is to have bioinformatics analysis of Musca domesitca antifungal peptide-1（MAF-1）and lysozymeb（LMZ）， also clone fused MAF-1-LMZ gene and have expression analysis of it. The encoding sequences of MAF-1 and LMZ were fetched from GenBank， and the structures and functions of 2 proteins were analyzed and predicted. The gene MAF-1-LMZ was amplified by polymerase chain reaction（PCR）， then was ligated into pET 28a and transformed into E. coli Origmi（DE3）competent cell， and induced with IPTG. The fusion protein MAF-1-LMZ in the expression vector was analyzed by SDS-PAGE. The activity of the protein was validated by methods of small test tube and doubling dilution. The open reading frame of the MAF-1-LMZ was 969 bp， encoding a putative protein consisting of 322 amino acids with a predicted molecular weight of 35 468.6 Da and pI of 8.31， indicating the gene expressed in E. coli Origmi（DE3）successfully. The purified target protein had the antifungal activity.

Musca domestica；antifungal peptide-1 with Lysozyme；recombinant expression；sequence analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.031

2014-09-01

國家科技支撐計劃（2011BAC06B12），國家自然科學(xué)基金項目（81360254），貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目（黔科合J字［2012］2038號）

彭傳林，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：2463749164@qq.com

吳建偉，男，博士，教授，研究方向：昆蟲免疫及應(yīng)用；E-mail：wjw@gmc.edu.cn