許 寧 萬英明

（吉林醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院口腔科，吉林 吉林 132013）

rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的影響研究

許 寧 萬英明

（吉林醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院口腔科，吉林 吉林 132013）

目的 研究rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的影響。方法 將人牙周膜成纖維細胞分別放在含有純培養(yǎng)液、含rhIL-1α培養(yǎng)液、含1，25-（OH）2D3培養(yǎng)液和含有rhIL-1α、1，25-（OH）2D3聯(lián)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并分別標記為D組、A組、B組和C組，培養(yǎng)48 h后，用熒光定量RT-PCR技術檢驗。結果 A組培養(yǎng)基中細胞表達RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加；B組培養(yǎng)基中細胞表達RANKL上升，但OPG下降，RANKL/OPG比值下降；C組培養(yǎng)基中RANKL上升，但對RANKL/OPG無明顯影響。結論 rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG有較大影響，且rhIL-1α、1，25-（OH）2D3聯(lián)合使用時對RANKL起到了協(xié)同作用。值得臨床進一步探究。

rhIL-1α；1，25-（OH）2D3；人牙周膜成纖維細胞；表達RANKL和OPG；影響

近年來，越來越多的人選擇進行固定修復及牙齒矯正。固定修復中基牙穩(wěn)定性與牙周膜質量密切相關，而牙齒矯正就需要牙槽骨的改建，此改建過程極為復雜，除了成骨、破骨細胞的參與外，還有許多牙周膜成纖維細胞也起到了重要作用［1］。人牙周膜成纖維細胞依靠著表達RANKL和OPG來影響骨細胞的活動，二者為破骨細胞的終末因子，調控著破骨細胞的分化、激活和成熟。近期研究發(fā)現(xiàn)rhIL-1α、1，25-（OH）2D3與人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG有一定的關系。因此，筆者通過研究rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的含量調節(jié)來為進一步進行牙齒矯正及固定修復提供更加合理的方法。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：此次試驗所需要的儀器有Trizol試劑（由康為世紀股份有限公司提供）、氯仿（由淄博卓凱經貿有限公司提供）、乙醇（由國藥集團化學試劑有限公司提供）、RT-PCR試劑盒（上海譜振生物科技有限公司提供）、SYBR熒光染料（由華美瑞康國際生物技術研究中心提供）、DEPC（上海如吉生物科技發(fā)展公司提供）、引物（由國藥集團化學試劑有限公司提供）、10 μg/L rhIL-1α、1×10-8mol/L 1，25-（OH）2D3等。

1.2 人牙周膜成纖維細胞的培養(yǎng)與鑒定：培養(yǎng)材料均來自于臨床上12歲左右青少年因正畸需要拔除的第一或第二前磨牙，且牙齒無任何損傷及其他疾病。將牙體放入培養(yǎng)液中，采用組織塊培養(yǎng)法將組織與細胞分離，培養(yǎng)液每3 d更換一次。取第三代人牙周膜成纖維細胞進行標記和染色，對細胞進行鑒定。將4～7代人牙周膜成纖維細胞作為實驗材料。實驗過程中按照合適的密度將細胞培養(yǎng)在65 cm2的培養(yǎng)基中，觀察細胞的生長和貼壁情況。代細胞完全貼壁后，吸取原有培養(yǎng)液，按分組進行誘導刺激，A組內加入rhIL-1α，B組內加入1，25-（OH）2D3，C組內加入rhIL-1α、1，25-（OH）2D3，D組不加入任何試劑，培養(yǎng)48 h后進行熒光測定。

1.3 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（FQ-RT-PCR）檢測RANKLmRNA和OPGmRNA的表達：①引物合成與設計見表1，由上海英俊公司合成。②細胞總RNA的提取與檢測：按照Trizol試劑盒的方法提取總RNA，凝脂糖凝膠電泳觀察RNA質量。③cDNA第一條鏈的合成在PCR管中加入RNA模板5 μL、Primer（50 mol/L） oligio（t）1 μL、dNTP Mix（10 mol/L） 1 μL、再加入DEPC水形成10 μL的Mixture1；65 ℃水浴5 min，然后立即放冰2 min；在10 μL的Mixture 1中加入10×RT butter 2 μL、鎂離子（25 mmol/L）4 μL；0.1 mol/L dTT 2 μL、RNaseout （40 U/μL） 1 μL、SuperScrip Ⅲ RT（200 U/μL） 1μL組成20 μL的體系，進行反轉錄反應。反應條件為50 ℃處理50 min，85 ℃處理5 min立即放置到冰上，在每管反應體系中加入1 μL的RnaseH 37 ℃處理20 min即獲得cDNA?？梢苑诺?20 ℃冰箱中保存。④熒光定量PCR擴增。PCR擴增技術中RNAKL反應過程為：95 ℃預變性2 min→95 ℃變性10 s→60 ℃退火20 s→72 ℃延伸45 s，共40循環(huán)；OPG反應過程為：95 ℃預變性2 min→94 ℃變性15 s→60 ℃退火30 s→70 ℃延伸30 s，共40循環(huán)，反應后進行曲線分析。

表1 擴增片段所用引物

1.4 統(tǒng)計學方法：采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據處理，資料采用χ2檢驗，P＜0.05有差異，P＜0.01有顯著差異，P＞0.05無差異。

2 結 果

2.1 48 h后各組RANKL和OPG的比較：經過48 h培養(yǎng)后可以發(fā)現(xiàn)，D組培養(yǎng)基中無明顯變化；A組培養(yǎng)基中細胞表達RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加；B組培養(yǎng)基中細胞表達RANKL上升，但OPG下降，RANKL/OPG比值下降；C組培養(yǎng)基中RANKL上升，但對RANKL/OPG無明顯影響。見表2。

表2 四組培養(yǎng)皿中表達RANKL、OPG和RANKL/OPG的比較

將A、B、C三組與D組進行比較，對比表達RANKL時：A組和D組比較t=4.8371，P=0.0008；B組和D組比較t=3.6742，P=0.0010；C組和D組比較t=24.4107，P=0.0000。對比表達OPG時：A組和D組比較t=22.0895，P=0.0000；B組和D組比較t=1.6675，P=0.0032；C組和D組比較t=1.6675，P=0.0153。對比表達RANKL/OPG時：A組和D組比較t=.9954，P=0.0037；B組和D組比較t=29.7945，P=0.0000；C組和D組比較t=1.0547，P=0.3284。

3 討 論

白細胞介素最初是由白細胞產生又在白細胞間發(fā)揮作用，所以由此得名，現(xiàn)仍一直沿用。最初是指由白細胞產生又在白細胞間起調節(jié)作用的細胞因子?，F(xiàn)在是指一類分子結構和生物學功能已基本明確、具有重要調節(jié)作用而統(tǒng)一命名的細胞因子，它和血細胞生長因子同屬細胞因子。RHIL-1α屬于白細胞介素-1，其又稱重組人白細胞介素-1α，是一種具有廣泛生物學活性的破骨細胞活化因子，是由活化的單核巨噬細胞產生，具有免疫調節(jié)和發(fā)生內分泌反應的作用，還可以促進人牙周膜細胞參與骨吸收活動。在以前的研究中發(fā)現(xiàn)重組人白細胞介素-1α可以影響成骨細胞的轉錄，本次試驗則可以證明重組人白細胞介素-1α對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG也有顯著效果。它可以將二者同時上調。

1，25-（OH）2D3又名1，25二羥基維生素D3。正常情況下，1，25二羥基維生素D3由它的前體25-羥膽固化醇在腎臟合成。人體每日生理合成的1，25二羥基維生素D3為0.5～1.0 μg。在骨形成活躍時期（例如生長或妊娠期），其合成量也略有增加。1，25二羥基維生素D3能促進腸道對鈣的吸收，并且調節(jié)骨質的鈣化。對于嚴重腎功能衰竭，特別是長期接受血液透析治療的患者，內源性骨化三醇的合成明顯減少甚至完全停止。在研究可以發(fā)現(xiàn)，在1，25二羥基維生素D3培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞表達RANKL上升，但OPG下降。說明這種因素有利于破骨細胞的生成，促進了牙槽骨的吸收。

從本次實驗中可以看出，A組培養(yǎng)基中細胞表達RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加（P＜0.05）；B組培養(yǎng)基中細胞表達RANKL上升（P＜0.05），但OPG下降（P＜0.05），RANKL/OPG比值下降（P＜0.05）；C組培養(yǎng)基中RANKL上升（P＜0.05），但對RANKL/OPG無明顯影響（P＞0.05）。因此可以看出，重組人白細胞介素-1α和1，25二羥基維生素D3與人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG有密切的關系。

目前，重組人白細胞介素-1α和1，25二羥基維生素D3是一個調節(jié)人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的有效預診手段，且此類檢測操作方便、成本低廉［5］。通過試驗可以得知重組人白細胞介素-1α和1，25二羥基維生素D3與人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG有密切的關系，但二者聯(lián)合使用時對RANKL/OPG既無明顯增加也無沒明顯下降的變化，所以研究具體原因及相關調節(jié)機制將是我們下一步研究的重點。

［1］ 張?zhí)m，孫琳琳，丁巖，等.IL-1β對人牙周膜成纖維細胞OPG、RANKLmRNA表達的影響［J］.牙體牙髓牙周病學雜志，2012，22（8）: 440-441.

［2］ 陳良嬌，蘭澤棟，陳建明.rhIL-1α、1，25-（OH）2D3聯(lián)合作用對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的影響［J］.口腔醫(yī)學研究，2012，4（28）:316-317.

［3］ 張?zhí)m，孫琳琳，丁巖，等.葡萄糖對人牙周膜成纖維細胞OPG、RANKLmRNA表達的影響［J］.中國美容醫(yī)學，2013，1（22）:71-72.

［4］ 陳良嬌，蘭澤棟，陳建明.重組人白介素-1α對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG影響的熒光定量RT-PCR研究［J］.口腔醫(yī)學研究，2010，26（2）:197-198.

［5］ 于鑫，王月秋，許海平.Toll樣受體2和4在脂多糖誘導人牙周膜成纖維細胞表達細胞核因子-B受體活化因子配基中的作用［J］.華西口腔醫(yī)學雜志，2012，3（30）:325-326.

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1671-8194（2015）13-0088-02