郭 淼（山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272111）

法舒地爾對(duì)大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)元細(xì)胞凋亡作用的研究

郭 淼
（山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272111）

目的 探討法舒地爾干預(yù)后對(duì)大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)元細(xì)胞是否具有抗凋亡作用。方法 解剖SD大鼠分離腦缺血/再灌注神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞，不同濃度法舒地爾干預(yù)后，運(yùn)用TUNEL法檢測(cè)大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 法舒地爾能明顯減少TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，且濃度越高作用越明顯。結(jié)論 法舒地爾干預(yù)后對(duì)大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)元細(xì)胞具有抗凋亡作用。

法舒地爾；細(xì)胞凋亡；神經(jīng)元細(xì)胞

法舒地爾（即鹽酸法舒地爾，F(xiàn) a su d i l hydrochloride，F(xiàn)H）是目前在臨床上唯一應(yīng)用的Rho激酶抑制劑［1］，最初只是作為一種血管擴(kuò)張劑，在神經(jīng)內(nèi)科用于防治蛛網(wǎng)膜下腔出血后的慢性腦血管痙攣，近年來(lái)其臨床應(yīng)用擴(kuò)展到心血管領(lǐng)域［2］。Rho激酶作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子開(kāi)關(guān)，參與許多機(jī)體重要的調(diào)節(jié)作用，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3-5］，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞黏附與遷移等。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠，體重80～100 g；法舒地爾注射液購(gòu)自中國(guó)山西普德公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Saldrich公司，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自澳洲Hyclone公司。

1.2 大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)元細(xì)胞分離與細(xì)胞傳代培養(yǎng)

選取體重80～100 g的健康雄性SD大鼠，麻醉、消毒后解剖取出腦組織，將腦組織移至超凈臺(tái)，放入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中洗凈血液。將其剖開(kāi)、剪成0.5～1 mm的小塊，然后立即移至含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基（DMEM）中，37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底90%左右時(shí)，0.25%胰酶消化，然后按1：3比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 法舒地爾藥物干預(yù)分組

待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%匯合度后換用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，然后換成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別加入不同濃度（1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L）的法舒地爾孵育48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分為四組：A為對(duì)照組；B組為法舒地爾1 μmol/L干預(yù)組；C組為法舒地爾10 μmol/L干預(yù)組；D組為法舒地爾100 μmol/L干預(yù)組。

1.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

移除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 m in，加入0.1% Triton X-100透化細(xì)胞2 m in；實(shí)驗(yàn)組各加TUNEL反應(yīng)混合液100 uL于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃，1 h。終止反應(yīng)：浸入2×SSC 15 m in；封閉POD：浸入0.3%H2O215 m in；酶標(biāo)反應(yīng)：加streptavidin100 uL標(biāo)記HRP（按1：500 PBS稀釋?zhuān)?0 m in；DAB顯色（避光）：加DAB混合液100 uL，10 m in左右加PBS或甘油1滴在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)500個(gè)細(xì)胞）并拍照。計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（胞核呈棕黃色顆粒）和細(xì)胞總數(shù)，以TUNEL陽(yáng)性率表示細(xì)胞凋亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以“±s”表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

TUNEL染色結(jié)果顯示，對(duì)照組有大量的細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比法舒地爾干預(yù)組細(xì)胞凋亡比例明顯降低，而且劑量越大降低越明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞凋亡直方圖

3 討 論

法舒地爾干預(yù)后對(duì)大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)元細(xì)胞具有抗凋亡作用，在下一步的工作當(dāng)中我們會(huì)對(duì)它的機(jī)制進(jìn)行研究［6-7］。

［1］ Sm lyo AP Som ly AV.Signal transduction by G-proteins Rho kinase and protein phosphatase to smooth muscle and non-muscle myosin II［J］.J Physiol，2010，522（Pt2）：177-185.

［2］ Fukumoto Y，Mohri M，Inokuchi K，et al.Anti-ischem ic effects of fasudil，a specific Rho-kinase inhibitor，in patients w ith stab le effort angina ［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2007，49（3）：117-121.

［3］ Otsuka t，Ibuki C，Suzuki T，et al.Adm inistration of the Rhokinase inhibitor，fasudil follow ing nitroglycerin additionally dilates the site of coronary spasm in patients w ith vasospastic angina［J］.Coron Artery Dis，2008，19（2）：105-110.

［4］ Satoh S，Utsunom iya T，Tsurui K，et al.Pharmacological profile of hydroxy fasudil as a selective rhokinase inhibit or onischemic brain damage［J］.Life Sci，2001，69（12）：1441.［5］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible m iddle cerebral artery occlusion w ithout craniectomy in rats［J］. Stroke，2009，20（1）：84-91.

［6］ 邵建林，王玲玲，王俊科，等.七氟烷激活PI3-K/A k t/ P70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制缺血/再灌注損傷神經(jīng)元的凋亡［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（11）：1362-7.

［7］ Rikitake Y，K im H H，Huang Z，et al.Inhibition o f Rhokinase（ROCK）leads to increased cerebral blood flow and stroke protection［J］.Stroke，2005，36（10）：2251-7.

本文編輯：吳玲麗

Effect of Fasudil Attenuates Neuron Cell of Rat Apoptosis

GUO M iao
（Shandong Province Jining City the first people's hospital，Shandong Jining 272111，China）

Ob jective To investigate the effect of Fasudil attenuates Neuron Cell of Rat apoptosis. M ethods Anatomy of SD rats were isolated from cerebral ischem ia/reperfusion neuron cells，different concentrations of fasudil intervention，using the TUNEL assay in rats w ith cerebral ischem ia/reperfusion neuronal cell apoptosis. Results TUNEL results showed attenuation of apoptosis on Neuron Cell of Rat。Conclusion Fasudil has the function of attenuate cell apoptosis.

Fasudil；Cell apoptosis；Neuron Cell；

R743

A

ISSN.2095-6681.2015.026.007.02